Isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen / stromale cellen afkomstig van menselijke placenta Tissue

The Human Research Ethics Commissies bij Mater Health Services, Koninklijke Brisbane en Women's Hospital, Queensland University of Technology en de Universiteit van Queensland keurde het onderzoek en het verzamelen van de menselijke placenta samples gebruikt in het onderzoek. Alle protocollen voldaan aan de nationale richtlijnen voor onderzoek. Patiënten mits schriftelijke toestemming van de hoogte van het gebruik van weefsel voor onderzoeksdoeleinden. Derde trimester placenta werden verkregen van gezonde moeders volgende routine keizersnede (CS) geboorten op termijn van bovengenoemde ziekenhuizen in Brisbane, Australië. Mannelijke tegenstrijdige zwangerschappen term monsters werden gebruikt in deze studie foetale onderscheiden van maternale cellen. Foetale geslacht werd bepaald door middel van ultrageluid voor de geboorte en / of visuele inspectie van de pasgeborene bij de geboorte door klinisch personeel. X en Y-chromosoom fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) werd gebruikt om verder te valideren geslacht en foetale of maternale oorsprong weefsel behoed deorigineel placenta's. 1. Voorafgaand aan Harvest, Bereid de volgende Opmerking: Bij het maken van enzymoplossingen dienen de specifieke eisen en concentraties van de fabrikant voor elk product worden gevolgd. Enzymen worden vaak geleverd als een ruw mengsel van eiwitten, dus soortgelijke enzymen van verschillende bedrijven waarschijnlijk verschillende activiteiten / concentraties. Om deze reden is het advies van de fabrikant moet worden erkend en oplossing preparaat kan dienovereenkomstig worden aangepast. Bereiden of te kopen 1,5 tot 2 L totaal steriele Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) voor dit protocol. Bereid collagenase I voorraadoplossing door afwegen van collagenase type I en los 1 mg / ml in HBSS en vortex zachtjes om volledige oplossing te verzekeren. Bepaal het volume van HBSS (met calcium en magnesium) nodig om collagenase oplossing voor 100 eenheden (U) / ul (1000x voorraad-oplossing) te brengen en vervolgens filteren met een 0,2 &# 181; m spuitfilter. Aliquot 1 ml volumes in 1,5 ml buisjes en bewaar bij -20 ° C totdat het nodig is. Bereid dispase voorraadoplossing door het oplossen van niet-steriele dispase bij 10 mg / ml in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder calcium of magnesium. Verdun met DPBS zonder calcium of magnesium tot een eindconcentratie van 2,4 U / ml. Filter steriliseer door een 0,2 urn spuitfilter. Aliquot 1 ml volumes in 1,5 ml buisjes en bewaar bij -20 ° C totdat het nodig is. Bereid deoxyribonuclease (DNase) -I voorraadoplossing door het oplossen DNase-I bij 10 mg / ml in 0,15 M NaCl. Filter thorugh een 0,2 urn spuitfilter. Aliquot 1 ml volumes in 1,5 ml buisjes en bewaar bij -20 ° C totdat het nodig is. De werkoplossing verteringsoplossing combineert 100 U / ml collagenase type I, I 5 ug / ml DNase I en 2,4 U / ml dispase in serumvrij DMEM. Vers ontdooid en verdund enzym voorraden onmiddellijk voor gebruik. Ongeveer een 1: 1 verhouding van ontsluitingsoplossingvolume weefselvolume vereist (bijvoorbeeld 10 ml weefsel, gemeten in een 50 ml buis vereist 10 ml ontsluitingsoplossing). Bereid een oplossing van 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS en op pH 7,4 15. WINKEL 25 ml porties bij -20 ° C voor lange termijn of bij 4 ° C gedurende 1 week. Bereid MSC kweekmedium DMEM-lage glucose (DMEM-LG), aangevuld met 1x antibiotica en antimycotische oplossing en 10% niet-hitte geïnactiveerd foetaal runderserum. MSC-grade FBS kunnen worden gekocht bij vele FBS leveranciers. Autoclaaf steriliseren dissectie apparatuur van tevoren als per institutionele richtlijnen. Deze omvatten schaar, pincet, scalpels, en een grote metalen dissectie lade. Verzamel extra steriele weefselkweek plasticware en hulpstoffen (bijv scalpelmesjes, 50 ml en 15 ml buizen, 25 ml, 10 ml en 5 ml pipetten, en 75 of 175 cm 2 celkweek flessen). Gebruik standaard primaire celcultuur laboratorium apparatuur: een klasse II biosafety kast geschikt voor primaire celisolatie, celkweek incubator ingesteld op 5% CO2 en 37 ° C, een tuimelschakelaar in een 37 ° C incubator, en een centrifuge met een capaciteit van 50 ml buizen. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen: een labjas, 2 paar handschoenen (ten alle tijden), veiligheidsbril en close-toed schoenen als per institutionele richtlijnen. Bereid gepaste decontaminatie oplossingen voor menselijke bloedmonsters volgens institutionele richtlijnen en vloeibaar biologisch afval containers op voorhand. 2. Isolatie van de placenta MSC Bereiding van de placenta Jurk in de vereiste persoonlijke beschermingsmiddelen. Het opzetten van de biologische veiligheid kast met benodigde materialen, oplossingen en afvalcontainers de procedure tot uit te voeren naar de enzymatische afbraak (paragraaf 2.5.6). Het verkrijgen van een placenta met informed consent en ethische goedkeuring. Verzamel de placenta via keizersnede sectie onder aseptische chirurgische omstandigheden en verpakking een steriele zak of bak voor transport naar het laboratorium. Tijdens transport en voorafgaand aan dissectie, slaan de placenta bij kamertemperatuur of 4 ° C. Opmerking: Weefsel kan worden bewaard tot 6 uur zonder dat celkweek prestaties. Beperk de tijd tussen placenta inzameling en verwerking weefsel waar mogelijk. Deze aanbeveling is gebaseerd op praktische zaken. In sommige gevallen hebben we de cel isolatiewerkwijze tot 6 uur na de geboorte vertraagd. In deze gevallen placenta zijn bij kamertemperatuur of 4 ° C (in het laboratorium of aan de verzamelplaats) gehouden. Geen detecteerbare verschillen waargenomen, bovenstaande algemene donor variatie in de MSC verkregen uit placenta wanneer ze bij 4 ° C of bij kamertemperatuur werden bewaard. Plaats de houder met placenta in de biologische veiligheidskast. Open de houder en breng de placenta in een steriele schaal. Open de foetale membranen (vruchtzak of amnion-chorion laeve) 8. Worden georiënteerd met de delen van de placenta. De foetale kant heeft de navelstreng insertie, die in het algemeen centraal geplaatst in de placenta. Moederszijde (bekleed met decidua basalis), die tegenover de foetale kant, heeft duidelijke zaadlobben (of lobben). Om de dissectie te beginnen, oriënteren de placenta met de navelstreng naar boven in de steriele lade. Opmerking: Dit protocol is ontworpen om voldoende cellen te zaaien in een T175 kolf van elk van de drie weefseltypen verkregen. Elke digest begint met ongeveer 10 g weefsel. Dit is een gelijkaardig startnummer kolven als MSC culturen geïnitieerd vanuit een 20 ml beenmergaspiraat. Als er meer cellen gewenst zijn, dan meer weefsel kan worden geoogst en het protocol kan lineair worden geschaald. De afmetingen van het weefsel te oogsten zijn slechts een indicatie van wat praktisch met de placenta weefsel. Er zijn weinig defining functies in de placenta villi, die kan worden gebruikt als referentiepunt. De opgegeven afmetingen dienen als schatting en de navelstreng wordt gebruikt als een baken op de foetale oppervlak. Dissectie van de deciduale (D) Tissue Flip de placenta om zodat de moederlijke oppervlak (decidua basalis) naar boven. Zorg ervoor dat de foetale kant met de navelstreng invoegpunt naar beneden is gericht. Knip stukjes van 0,5 cm dikte van de moederlijke kant van de placenta (met decidua basalis weefsel). Plaats stukken weefsel in een petrischaal met HBSS tijdens de dissectie de stukken weefsel gehydrateerd. Transfer voldoende weefsel om een ​​buis te vullen tot de streep 10 ml in een buis van 50 ml (dit is ongeveer 10 g weefsel). Dissectie van de chorion Plate (CP) Tissue Mechanisch verwijderen van het vruchtwater membraan van de foetale oppervlak van de placenta (niet de vruchtzak), waardoor de chorionic frondosum (chorionic plaat) intact. Knip stukjes ~ 1 cm breed en 0,5 cm diep uit de chorionic plaat. Oogst de chorionic plaat uit het gebied het dichtst bij de navelstreng, weg van de rand van de placenta. Plaats stukken weefsel in een petrischaal met HBSS tijdens de dissectie om ze gehydrateerd. Transfer voldoende weefsel in een 50 ml buis te vullen tot de streep 10 ml (~ 10 g weefsel). Dissectie van de vlokken (CV) Tissue Ontleden CV weefsel ~ 1 cm 2 x 0,5-1 cm diep uit placentaweefsel waar de CP al is verwijderd. Nogmaals, oogst CV van het gebied het dichtst bij de navelstreng, weg van de rand van de placenta. Proberen te blijven ten minste 1 cm afstand van de moederlijke kant van de placenta (met decidua basalis weefsel); het doel is om weefsel te oogsten uit het inwendige van de placenta villi weefsel. Plaats stukken weefsel in een petrischaal met HBSS gedurende het dissection om hen gehydrateerd te houden. Transfer voldoende weefsel in een 50 ml buis te vullen tot de streep 10 ml (~ 10 g weefsel). Mincing en enzymatische afbraak van de D, CP, en CV placenta weefsels Aangezien er ~ 10 g D, CP of CV weefsels in drie verschillende 50 ml buizen vul elke buis met ongeveer 40 ml HBSS en herhaaldelijk omkeren van de buis om het weefsel te wassen (herhaal voor ~ 10 sec). Decanteer het supernatant en herhaal deze wasstap 2-3 keer totdat de oplossing grotendeels vrij van bloed. Gebruik een 10 ml pipet of lange pincet te zorgen voor de weefselstukken niet verloren uit de buis (en) bij decanteren van de bovenstaande vloeistof. Terugkeren weefselstukjes een 10 cm petrischaal met minimale vloeistofoverdracht. Chop / gehakt het weefsel in fijne stukjes van ongeveer 1-5 mm 3 met een schaar of scheermesje. Breng het gehakt weefsel terug in gepaste label (D, CP of CV) 50 ml buizen. Voeg vers prepared verteren media in ten minste een 1: 1 verhouding met het weefsel (bijvoorbeeld 10 ml weefsel plus 10 ml verteren media). Plaats de dop op elke buis en draai de buizen meerdere malen om te mengen. Incubeer de weefsels in de buizen met digest media gedurende 1-2 uur bij 37 ° C. Een vochtige atmosfeer en 5% CO2 niet nodig voor deze stap. Opmerking: Rapid schudden vereist om cellen van het weefsel efficiënt dissociëren en MSC maximale opbrengst. Limited opbrengst zal duidelijk zijn door zeer weinig cellen op 48 uur en een eerste passage langer dan 1-2 weken aan de cultuur kolf. De incubatietijd en schudden werkwijze afhankelijk van de 37 ° C incubator in het laboratorium en kunnen optimalisatie vereisen. Voor een incubator met een snelle en controleerbare schudden mechanisme, plaats weefsel en verteren medium in een 50 ml buis of steriele erlenmeyer, plaats in de incubator en stel schudden snelheid tot 250 rpm. Dit resulteert in een complete digestie vanhet weefsel in 1 uur. Als alternatief voor een incubator met een zachte rockende of geen schommelen mechanisme, hand schudden de buis snel en krachtig met de hand gedurende 10 sec elke 30 min gedurende 1,5 tot 2 uur. Het enzym incubatietijd is een geschikte tijd om afval te ontdoen, duidelijk de bioveiligheid kabinet van onnodige voorwerpen, veranderen laboratoriumjas als vuil en voor te bereiden voor het volgende deel van de procedure. Het verzamelen van mononucleaire cellen en Plating in Flessen Opmerking: Van de vorige stap zijn er drie 50 ml buizen (D, CP of CV) met digereren stukken weefsel. Wanneer het weefsel digest oplossing evolueert een bewolkte verschijning en witte bloedvaten zijn duidelijk in het weefsel, de spijsvertering is voltooid. Voeg 30 ml MSC medium met FBS aan elke buis om de enzymen in de verteringsoplossing inactiveren. De mononucleaire cellen te scheiden van de grote onverteerde puin, Pulscentrifugeer de 50 ml buis. Kort toestaande centrifuge tot 340 x bereiken g gedurende 5 seconden en dan stoppen. Dit zal de grote brokstukken dwingen pellet op de bodem van de buis, terwijl de mononucleaire cellen in vloeibare suspensie. Opmerking: De mononucleaire cellen in de vloeistoffase blijft indien de buis kortdurend (gepulseerd) gecentrifugeerd. Als centrifugeren wordt verlengd, wordt de mononucleaire cellen ook pellet op de bodem van de buis met het weefsel stukken, leidt tot ongewenste celverlies. Verzamel de supernatant met de mononucleaire cellen en breng deze in een nieuwe 50 ml buis met een pipet. Voeg 30 ml van de media of HBSS om de resterende placenta weefsel puin en schud krachtig. Dit zal de resterende vrijstaande mononucleaire cellen te brengen in suspensie en maken een tweede oogst van de vermeende MSC uit het weefsel. Pulse centrifuge de buis een tweede keer, en opnieuw over de bovenstaande om een ​​nieuwe 50 ml buis. Herhaal deze stap voor de derde keer aan de collectie efficiëntie te maximaliserenmononucleaire cellen uit elke weefselbron. de supernatanten van elk van de afzonderlijke weefselsoorten pool in twee 50 ml buisjes. Dit zal 6 tubes in totaal (2 tubes van elk D, CP en CV) opleveren. Centrifuge elke buis gedurende 5 minuten bij 340 x g. Deze stap zijn mononucleaire cellen pellet op de bodem van de buizen. Zorgvuldig giet of pipet uit de bovenstaande vloeistof in het afval. Behoeft proberen om elke druppel supernatant te elimineren. Opmerking: De celpellet wordt kwetsbaar vanwege een groot aantal rode bloedcellen. Wees voorzichtig dat u de pellet ongeluk weggooien als u rechtstreeks decanteren van de 50 ml buis. Na het verwijderen van de meeste van de bovenstaande vloeistof voorzichtig flick de buis meerdere malen met een vinger om de celpellet te verwijderen. Combineer de pellets, zodat er een buis voor elke D, CP of CV weefsel en resuspendeer elk in 35 ml van MSC media. Optioneel: Filter de mononucleaire fractie door een 100 um mesh cel zeef SETUp in een 50 ml buis naar cel klonten of vezelig materiaal te verwijderen. Opmerking: Zorg is vereist als de filters gemakkelijk kunnen verstoppen en over-fill. Daarnaast kunnen luchtbellen filters belemmeren van aftappen. Als dit gebeurt, langzaam til de filter uit de buis om de lucht te laten stromen onder het filter, wassen filter door middel van media voor celkweek of uitwisseling naar een nieuwe filter. Exclusief de filtratiestap lijkt geen opbrengst of kwaliteit van de daaropvolgende MSC kweken verandert. Eventueel een rode bloedcel (RBC) lysis of dichtheidsgradiënt centrifugatie kan in dit stadium 15 uitgevoerd. Maar onze ervaring is dat RBC niet interfereren met MSC aan- resp proliferatie en derhalve RBC lysis is niet noodzakelijk. Mononucleaire cellen kunnen worden geteld bij deze stap als RBC verwijdering 15 uitgevoerd. Hoewel de overgrote meerderheid van de cellen in deze fase niet MSC, maar zijn foetale oorsprong trofoblasten, endotheliale cellen en hematopoietische cellen, en materne oorsprong hematopoietische cellen en decidua stromale cellen. Breng de celsuspensie per D, CP of CV weefsel in een T175 kolf en cultuur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Post Isolatie-cell Expansion Op 48 uur na de oorspronkelijke isolatie Verwijder het medium uit elk van de kolven (D, CP cv) en vervangen door 35 ml vers medium MSC. Het verbruikte medium en losgemaakte cellen kunnen worden gebruikt omdat vermeende MSC, worden geacht aan de weefselkweek kolf 16. Terugkeren kolven naar de incubator voor een verdere 24 uur. Na nog eens 24 uur cultuur, was de kolven tweemaal met DPBS (25 ml) om afval en RBC's te verwijderen. Zwenk de vloeistof rond de bodem van de kolf RBC's te verwijderen. Gebruik een pipet om vloeistof en vuil te verwijderen. Voeg 35 ml MSC media om de kolven en de terugkeer van de flessen naar de incubator. Vervang de media twee keer per week, en incubate kweken totdat de celmonolagen zijn 80- 90% confluent. Deze eerste expansie duurt 4-14 dagen, afhankelijk van de kwaliteit van het weefsel, hoeveelheid uitgangsmateriaal en efficiëntie en incubatietijd met de digest oplossing. 3. Subculture van pMSCs Wanneer culturen 80-90% confluent, twee keer wassen met 20 ml 1x HBSS of DPBS en gooi wasbeurten. Voeg trypsine-substituut voor elke kolf (dwz gebruiken 5 ml voor een T175 kolf). Incubeer de kolven gedurende 5 minuten bij 37 ° C MSC bevrijden van de weefselkweek oppervlak. Tik op de zijkanten van de kolf elke ~ 2 min tot onthechting te vergemakkelijken. Wanneer cellen worden losgemaakt van het oppervlak en een enkele celsuspensie, was de cellen uit de kolf MSC media en het verzamelen van de cellen in buizen. De MSC media zal verdunnen en deactiveren van de trypsine-vervanger (gebruik ~ 15 ml van MSC media per T175 kolf). Breng de inhoud van elke weefselkweek kolf een 50ml buis. Centrifugebuizen bij 340 xg gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellets in 1 ml MSC media. Verdun 10 pi celsuspensie in 10 pi trypan blauw. Aantal cellen met een hemocytometer en bereken het totale aantal cellen 15. Transfer cellen nieuwe kolven bij 1150 cellen / cm2 in verse MSC media en incuberen in een weefselkweek incubator. Dit zaaidichtheid, zaad 200,000 MSC naar elke nieuwe T175 kolf 35 ml van MSC media. Voeden cellen tweemaal per week tot 80-90% confluent. Zaad daaropvolgende passages op 1150 cellen / cm 2 of 200.000 MSC in elk T175 kolf. Wanneer de passage 1 (P1) of P2 cellen confluent cryopreserve de meerderheid van de cellen voor toekomstig gebruik, en reseed slechts een T175 kolf voor verdere vermeerdering en karakterisering. De gekweekte cellen kunnen gebruikt worden op P3 en P4 voor mesodermale differentiatie assays en cel karakterisering via flow cytometrie. Opmerking: In vroege passages kunnen er weinig dun gescheiden kolonies, maar de lokale celdichtheid in elke kolonie kan zeer hoog zijn. Dit is niet ideaal, omdat de lokale dichte pakking van de cellen zal resulteren in contactinhibitie, vertragen de groei en vermindering cultuur prestaties. We raden wanneer dichte kolonies worden waargenomen, moet de cellen worden geoogst en opnieuw uitgezet in een nieuwe fles. Deze herverdeling werkwijze verschaft cellen met ruimte om te prolifereren, en de algehele cultuur prestaties worden verbeterd. MSC cryopreserve verzamelen ~ 1 x 10 6 cellen in 1 ml 90% FCS en 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en vries behulp van standaard protocollen. Opmerking: In de resultaten representatief gedeelte, zijn er beschrijvingen van MSC karakterisering met behulp van flowcytometrie, mesodermale differentiatie en XY FISH analyse om het geslacht van de drie verschillende (D, CP en CV) uitgebreid celpopulaties te bepalen. In onze studie, placenta's waren afkomstig van mannelijke baby's; dus allefoetale cellen kunnen worden onderscheiden mannelijke (Y chromosoom) en alle maternale cellen kunnen (alleen X-chromosoom) worden onderscheiden vrouwelijke.