カッパ（Vκ）に対する抗体の結合特異性軽鎖を含むヒト（IgM抗体）抗体：ポリシアル酸（PSA）ケーススタディとしてNCAMに添付

動物のプロトコルおよび手順は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施し、メイヨークリニックの制度的動物のケアと使用委員会（メイヨーIACUCプロトコル番号＃A51912）によって承認されました。 1.一般的なCNS組織の準備ヘテロ接合体を交配することによって、ヘテロ接合NCAMマウスと野生型（WT）同腹子（C57 / BL6）（博士リンLandmesser、ケースウェスタンリザーブ大学、クリーブランド、オハイオ州によって提供された）C57 / BL6の背景にNCAM欠損（KO）マウスを生成します。 NCAMノックアウトマウスの遺伝子型決定は、以前32-34に記載され、さらに詳細には説明しません。 注：1.2ステップ- 1.6はオプションです。 手術の前に、ペントバルビタールソリューションの管理（在庫：25 mg / mlで、出生後早期それぞれの大人のステージのためにペントバルビタールの50/100μl）を腹腔内注射（27ゲージ針と1ミリリットルを経由してシリンジ）。 2分間、または動物が麻酔の外科的平面に達するまで待ちます。麻酔の外科的平面を維持するために、各操作の過程で必要に応じて追加の麻酔薬を投与します。麻酔の深さを決定するために、つま先のピンチ応答メソッドを使用します。動物は、続行する前に応答しなくなければなりません。 ちょうど胸郭の下に外皮および腹壁を通して1センチメートル横切開 – 0.5にします。慎重にダイヤフラムから肝臓を分離します。湾曲した、鈍いはさみを使用して、振動板に小さな切開を行います。胸膜腔を公開するために胸郭の全長に沿って横隔膜切開を続けます。 慎重に肺を変位、胸郭の一方の側に沿って湾曲し、鈍いはさみを置き、鎖骨に胸郭アップカットスルーを行います。対側に同様のカットを行います。離れて胸骨を持ち上げる、慎重に心にそれを接続する任意の組織をトリミング。 動物に切開を作りますできるだけ大きなアウトレットを作成するために、虹彩のはさみを使用して、右心房。ゆっくり動物の左心室の中にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を10mlを注入（赤色光、流速：1ml /分）を27ゲージ針を備えた10mLのシリンジを使用して。組織破壊を回避するために、灌流中に圧力/ PBSの流れを増加させないでください。 外科用ハサミを使用して、新生児マウスに首を切ります。 鉗子で眼窩をつかんによって、および脊柱の中に小さなハサミを挿入することによって、脳を削除してください。耳のレベルで前方に向かって頭蓋骨をカットします。ピールバックスカル、ゆっくり氷（ 表1）氷のように冷たい解剖培地10mlを充填した60ミリメートルペトリ皿に脳を置きます。 1.5ミリリットルのマイクロチューブにそれぞれ脳を置き、直ちにドライアイス（-79ºC）に格納します。 氷の上できれいなカミソリの刃を使用して、凍結した脳から小脳や脳幹を切開。組織を解凍避けるために、迅速に作業。 量りますμlの溶解緩衝液あたり150μgの脳組織の最終濃度まで凍結大脳、氷上で15 mlチューブに入れ、氷冷溶解緩衝液を追加する（ 表1参照）。残りの大脳のために繰り返します。 1.11 – ステップ1.9のためにすべての回で氷の上で脳を保管してください。 27ゲージの針（10倍）を搭載した5mLのシリンジを介して粉砕し、続いて1mLのピペットチップ（10倍）を介して粉砕して、溶解緩衝液で脳をホモジナイズします。完全な組織の溶解を可能にするために、氷上でさらに30分間脳溶解物をインキュベートします。 （4℃で10分間19000×gで4ラウンド）界面活性剤不溶性材料と脳シリアル遠心分離を介して脂質を除去。廃棄（白）ミエリン、ペレットを含む細胞の破片が、すべての遠心分離工程後の上清を保持しています。 -80ºCでアリコート脳溶解物およびストア。 大脳からの「プルダウン」をエージェントとしての人間のIgM（HIgM12とアイソタイプコントロールのIgM）を使用する2.免疫沈降WT lの溶解物とNCAM KOマウス プロテインLアガロースビーズ準備9,35,36 BSA（ 表1参照）を含むIP緩衝液の200ミリリットルを準備します。 BSAせずに同じIPバッファの別の200ミリリットルを準備します。 免疫沈降反応転送1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに200μlのピペットを用いて、プロテインLアガローススラリー100μlのあたり。プロテインLアガロースビーズをボルテックスしないでください！各チューブに（ 表1参照 ） を IP緩衝液1mlを加えます。反転（5回）を介して手動でプロテインLアガロースおよびIPバッファを混ぜます。 卓上型遠心分離機（千×gで、2分間、25ºC）で遠心分離することによって、タンパク質Lアガロースビーズを4回洗浄します。アガロースペレットを乱すことなく、200μlのピペットを用いて上清を脱ぎます。繰り返し洗濯は2.1.2 3 2.1.3への追加の回を繰り返します。 4ºCで終夜ローラー上に新たに追加されたIP緩衝液1ml中にプロテインLアガロースを平衡化します。 ウェスタンブロットでの抗体-抗原-アガロースL複合体の形成および抗原の検出 4ºCでローラー上で一晩1.5mlの微小管にIgM抗体（HIgM12）20μgので氷冷IP緩衝液1mlに溶解した脳組織（〜200μlの溶解液）30mgをインキュベートします。 千XG、4ºCで2分間ベンチトップ遠心分離機で（ステップ2.1.4から）プロテインLアガロースビーズをスピンダウン。アガロースペレットを乱すことなく、200μlのピペットを用いて上清を捨てます。 1ミリリットルピペットを用いてタンパク質Lアガロースに（ステップ2.2.1から）チルド抗体脳ライセート溶液を追加します。 4ºCでローラー上で2時間、抗体 – 抗原タンパク質Lアガロース懸濁液をインキュベートします。 2分、4ºC1000×gの遠心分離を介してLをアガロースに結合させた抗体 – 抗原複合体を洗ってください。ペレットを乱さないように注意して上清を廃棄し、0.2％BSAを含む氷冷IP緩衝液1mlを加えます。 0.2％BSA及びBSAなし氷冷IP緩衝液を用いてさらに2回を含む氷冷IP緩衝液を用いて洗浄工程をもう一度繰り返します。 2分、4ºC1000×gでLをアガロースに結合させた抗体 – 抗原複合体をスピンダウン。完全に最初の溶液50μlを10μlのピペットに続くプロテインLアガロースペレットの上に残っている〜まで200μlのピペットを用いて上清を捨てます。氷上でサンプルを保管してください。 IPの溶出緩衝液の40μl加え95ºCで5分間1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ、指のフリック管6回と熱あたり（ 表1参照）。 2分間氷上にサンプルを入れて、13,000×gで30秒間スピンダウンし、4ºC。 ペレットを乱すことなく新し​​い1.5 mlマイクロチューブに10μlのピペット（〜35μlの合計）を用いて上清を移します。内管壁に溶出された試料の少量をダウンすすぐことによってプロテインLアガロースビーズが存在しないことを確認します。 注：「粒状」タンパク質Lアガロースビーズ存在する場合はっきりと見えます。 プロテインLアガロースビーズが存在する場合、13,000×gでさらに30秒間試料をスピンダウンし、チューブを洗浄するために上清を移します。何アガロースビーズが検出されなくなるまで、手順を繰り返します。 負荷10 -トリス/グリシン/ SDS緩衝液系におけるSDSポリアクリルアミドゲル上でウェル当たり溶出サンプルの20μlの（ 表1参照）。 注：使用して7.5％または4 – PSA-NCAMまたはNCAMアイソフォーム（ゲル寸法（幅×長さ×厚さを検出するためのウェルあたり50μlのローディング体積で20％勾配ゲル：8.6 X 6.7 X 0.1センチメートル）。 ベンチトップで100 V（1.74 V / cm 2）でで〜1時間ゲルを実行します。追加の冷却は、このステップ37,38のために必要とされていません。 （ 表1を参照） – （10ºC5）コールド転送バッファを使用して100 V（1.74 V / cmの2）での低温室で2.5時間、PVDF（ポリフッ化ビニリデン）膜（孔径0.45μm）に伝達タンパク質。 ブロック膜ワット10％ベンチトップオービタルシェーカー上で25ºCで1時間、PBS-Tで（w / v）の乾燥粉乳i番目、PBS-5％BSA中で一晩、一次抗体をPBS-Tとプローブとの10分間の二回膜を洗浄寒い部屋でオービタルシェーカー上のT。 25ºCで簡単に過剰のPBS-Tで翌朝洗浄膜1時間は10分でオービタルシェーカー上の各（80回転）をPBS-Tで3回洗浄した（ふたと容器を含む）（すべての洗浄工程を25で実施されますºC）。 オービタルシェーカー上で25ºCで1時間のためにPBS-Tで5％ドライミルクパウダー30,000）（70回転数：二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）がHIgM12のための抗ヒト抗IgM抗体を（抱合）（希釈1を追加します。 ）。 ウォッシュ膜が広範囲に25ºCで簡単に過剰のPBS-Tで1時間は10分でオービタルシェーカー上の各（80回転）をPBS-Tで3回洗浄した（ふたと容器を含む）（すべての洗浄工程は、25ºCで行われています） 。 チルド強化chemiluminescenの1ミリリットルを混ぜます25ºCで（ミニブロットあたり）成分B（酸化剤）の1ミリリットルでのce HRP基質成分A（強化ルミノール試薬）。 （非常に縁でそれらを保持）過剰な液体を除去するためにペーパータオルの上膜を転送するためにプラスチック製のピンセットを使用してください。ペーパータオルでドライコンテナやコンテナ（各膜のための1）に戻し膜を置きます。すぐに各膜に予備混合し、増強化学発光HRP基質（化合物A + B）（ステップ2.2.16。）の2ミリリットルを追加し、オービタルシェーカー（90回転）に25ºCで2分間インキュベートします。膜を均一に化学発光試薬によって湿らせていることを確認します。 透明なプラスチック製のスリーブへの転送の膜をし、ペーパータオルで余分な液体と気泡を除去します。フィルムカセットにプラスチックスリーブ内膜を入れて、最終的にはカセットにプラスチック製のスリーブをテープで固定します。カセットを閉じます。 暗室にカセット、フィルム、タイマーやはさみを取ります。各Fiのから右上隅を遮断配向のためにLM、時間の異なる期間（異なる）フィルム（10秒、1分、10分）を露出し、フィルム現像液中膜を開発します。 3. Endoneuraminidase-NF NCAM 39に取り付けられているPSAの消化 表2 39に示すように、生後日（P）7 WTマウスとP7 NCAM KOマウスからのダイジェスト溶解した脳組織はendoneuraminidase-NF（ENDO-NF）を使用して、氷上で2時間（ステップ1.12から調製します）。 ステップ3.1（ 表2）から- （6 1）各チューブに4倍Laemmliサンプルバッファー5μlを添加します。 4上の負荷サンプル – 20％勾配SDSポリアクリルアミドゲルとリピートは2.2.19に2.2.10繰り返します。 PBS中5％BSAでHIgM12（を1μg/ ml）を、市販の抗PSAモノクローナル抗体（クローン2-2B）（1μg/ ml）およびβアクチン抗体（ローディングコントロール）（1μg/ ml）でプローブ膜-T。 ラットとマウスのCNS文化の4準備<strong>ガラスカバースリップの準備ガラス容器を使用して、ドラフト中16時間 – 4のための60ºC – 50で1MのHClにおける酸洗浄25ミリメートルのガラスカバースリップ。時折穏やかに旋回を介してカバースリップを攪拌します。 蒸留水（3×）で広範囲にカバーガラスを洗ってください。積み重ねられたカバースリップの間に酸を洗い流すようにしてください。 100％エタノール中でカバースリップを洗浄し、細胞培養フード中でパラフィルム上に乾燥します。ある日の使用前に、オーブンで100ºCで蓋付きのガラス容器中で24時間、カバーガラスを加熱します。 37ºCで1時間滅菌水で40 / mlのポリ-D-リジン3mlで6ウェルディッシュとコートでカバーガラスを置きます。 滅菌水で2回洗浄、細胞培養フードの下で完全に乾燥させ、20分間UV光を適用します。 CNS細胞のための組織培養プラスチックの調製 3でコート60 mmの細胞培養皿または75cm 2の組織培養フラスコmlまたは10ミリリットル、それぞれ、37ºCで1時間滅菌水中/ mlのポリ-D-リジン40μgのの。 細胞培養フードの下で完全に乾燥させ、20分間UV光を適用し、水で2回洗浄します。 ラット混合グリア・アイソレーション40 IACUCに新生児ラットを麻酔は（完全自動化）CO 2ガスの供給と齧歯類安楽死室を承認しました。動物の無応答性を決定するために、つま先のピンチ応答メソッドを使用します。 （ – 一度に10仔6）新生児のスプラーグドーリーラット（P0P1）を刎ねます。 鉗子で眼窩をつかんによって、および脊柱の中に小さなハサミを挿入することによって、脳を削除してください。耳のレベルで前方に向かって頭蓋骨をカットします。ピールバック頭蓋骨と優しく氷氷のように冷たい解剖培地10mlを充填した60ミリメートルペトリ皿（ 表1参照）に脳を置きます。 （ – 10仔6）残りのラットの子のために繰り返します。 4.3.7 – 手順4.3.2氷上で組織を保管してください。 </李> 2大脳半球に正中線に沿って大脳を分割し、その後、嗅球を遮断、大脳皮質とデュモン鉗子で海馬以下基底核。氷上で解剖培地を含むきれいなペトリ皿に孤立した大脳皮質を置きます。 1皮質を取ります。解剖顕微鏡下で微細な先端を有する鉗子で髄膜を除去します。 残りの皮質に繰り返します。氷上で1きれいなペトリ皿にすべて髄膜フリー皮質を置きます。 60ミリメートルペトリ皿にすべての仔から皮質半球を合わせ、みじん切り1ミリメートル片に脳組織をダイシングする滅菌カミソリの刃を使用します。 無菌の、コーティングされていない500ミリリットルのガラスフラスコに10ミリリットルピペットを用いてみじん切り脳組織を移し、ラット脳あたりの氷のように冷たい解剖培地10mlを追加します。ラット脳当たりHBSSの9ミリリットルにHBSS（ハンクス液）中のトリプシン溶液の1ミリリットル（5 mg / mlでトリプシン）を加えながらゆっくりフラスコを旋回。 2を追加します。DNアーゼI溶液（1mg / ml）し、MgSO 4溶液中の総体積の2％の総体積の％（HBSS中の3.82％のMgSO 4（W / V））脳組織懸濁液を、穏やかに旋回。 37ºCで30分間回転シェーカー上で穏やかに振盪下でトリプシン処理組織。組織片は、このステップ中に浮遊していると、底に沈殿しないことを確認してください。必要に応じて回転速度を上げます。 10％（V / V）の最終濃度になるようにウシ胎児血清（FBS）を追加し、10秒間フラスコを10回旋回することによって混合します。 15分間氷水で組織懸濁液をクールダウン。スワールを静かに5回毎秒分をフラスコ。 ゆっくり200×gで、4ºCで25ミリリットルまたは50ミリリットルのピペットと5分間の遠心分離器を使用して滅菌50mlチューブに組織懸濁液を移します。 上清を捨て、ゆっくりとウシ胎児血清の5ミリリットルを補足した氷冷解剖培地15ミリリットル、0.4ミリリットルのMgSO 4溶液（3.82パーセントで消化CNS組織を再懸濁HBSS中MgSO 4）し、DNアーゼI（1 mg / mlで）1.6 mlです。 懸濁液は濁っ/乳白色になるまで均等にゆっくりと2の滅菌15ミリリットルチューブ（〜10ミリリットルずつ）とに分割組織懸濁液は、10 mlピペット（10回）を使用して粉砕します。次のチューブの処理中に氷の上に懸濁した細胞を保管してください。残りの消化されたCNSは、チューブの底に沈殿物を組織するまで3分間待ちます。ペレット画分を乱すことなく50ミリリットルチューブをきれいにするために上清を移します。 必要に応じて、40ミクロ​​ンの細胞ストレーナーを通して濁った上清を通過させ、氷上の無菌の50ml試験管に、得られた単一細胞懸濁液を組み合わせます。 200×gで、4ºCで5分間細胞スラリーをスピン。 メディアを解剖する〜2ミリリットルの細胞ペレットの上に残されるまで、慎重に10ミリリットルのピペットを用いて上清を除去します。 50mlチューブ（〜10倍）で指フリック細胞ペレット。穏やかながらゆっくりと細胞懸濁液に（ 表1参照）暖かい増殖培地の5ミリリットルを追加します。チューブを旋回手。 必要に応じて、目に見える組織クラスタまたはDNAの塊の場合には、新鮮なDNアーゼI溶液、そしてMgSO 4 -溶液と氷上でさらに10分間のDNaseステップ4.3.12を繰り返します。スワールチューブ手動で5回毎秒分。 プレート6ウェルディッシュ中の400μlの増殖培地の水たまりで25ミリメートルのガラスカバースリップあたり50,000個の細胞と細胞は細胞培養インキュベーター（5％CO 2、37ºC）で30分間添付してみましょう。 コンフルエントのための（24以内- 48メッキ後の時間）60ミリメートル細胞培養皿と75cm 2の組織培養フラスコ、プレート500,000個の細胞（60ミリメートル皿）または2万個の細胞（75cm 2のフラスコ）。 静か各ウェルに2ミリリットル（6ウェルディッシュ中のウェルあたり、25ミリメートルのガラスカバースリップ）、暖かい増殖培地の3ミリリットル（60ミリメートルディッシュ）または10ミリリットル（75cm 2のフラスコ）を追加します。一晩細胞をインキュベートし、翌朝培地を完全に変更します。次に、培地一日おきに（3日目、5日目、7日目、 など ） を変更します。 いいえテ： – メッキ後48時間ラット混合グリア培養物は、免疫細胞化学または生化学24のた​​めに使用する準備が整いました。 マウス混合グリア培養 4.3.6へのセクション4.3.1で説明した新生児ラットの脳の解剖と同一の、脳を除去し、氷冷解剖培地に入れ、C57 / BL6の背景にP0の新生児WTとNCAM KOマウスを刎ねる（ 表1参照）。すべての回で氷上で組織を保管してください。 2大脳半球に正中線に沿って大脳を分割し、その後、嗅球を遮断、大脳皮質とデュモン鉗子で海馬以下基底核。氷上でHBSSを含むきれいなペトリ皿に孤立した大脳皮質を置きます。 1皮質を取ります。解剖顕微鏡下で微細な先端を有する鉗子で髄膜を除去します。残りの皮質に繰り返します。氷上で1きれいなペトリ皿にすべて髄膜フリー皮質を置きます。 皮質hemispheを転送独立した、無菌の15ミリリットルチューブに各マウスから1ミリリットルピペットで解像度。各脳に1.2ミリリットルの氷冷解剖培地を追加し、機械的にそれを2回までと1ミリリットルピペットチップを使用してダウンをピペッティングすることにより脳組織を崩壊させます。 150μlのパパイン溶液（PBS中10mg / ml）を、100μlのDNアーゼI溶液（HBSS中1mg / ml）を、各脳へ50μlの硫酸マグネシウム（HBSS中の3.82パーセント）を追加し、指のフリックによって混ぜます。 水浴中で37ºCで30分間脳のサスペンションをインキュベートし、指のフリックすることにより、脳の懸濁液を毎秒分を混ぜます。 、チューブ当たりFBSの1ミリリットルを加え混合し、氷上で10分間、組織懸濁液を冷却。 200×gで4分間の脳組織をスピンダウンし、4ºCおよびDNアーゼI溶液70μlの（HBSS中で1mg / ml）し、MgSO 4溶液を30μlを補充した氷冷解剖緩衝液1mlで組織ペレットを再懸濁（HBSS中の3.82パーセント）。 FBSでコーティングされた1mLのピペットチップを使用して、脳組織を粉砕します（〜5倍）上清を濁るまで。 40ミクロ​​ンの細胞ストレーナーを通して上清をパスし、氷の上にきれいなチューブに移します。 200×gで、4ºCで5分間の遠心分離を介して混合グリア細胞をペレット化。培地〜100μLまで吸引上清を細胞ペレットの上に残されます。指フリック（〜5倍）と暖かいマウスの増殖培地の1ミリリットルを追加することによって再懸濁細胞ペレット（ 表1参照）。 必要に応じて、目に見える細胞クラスターおよび溶解した細胞を溶解/そっと細​​胞懸濁液アップと（5回）をピペッティングしてDNAを沈殿させました。 4.3.21 – ステップ4.3.19で説明したようにPDLでコーティングされたガラスカバースリップまたは60 mmディッシュにプレートマウス混合グリア細胞。暖かいマウスの成長培地、その後隔日で翌朝細胞を洗浄。めっき後72時間 – マウス混合グリアは、免疫細胞化学48に使用する準備ができています。 ラットミクログリアの分離 培養ラットを混合します10日間増殖培地中で75cm 2の組織培養フラスコ中のグリア（ 表1参照）。 1時間140 rpmで細胞培養インキュベーター（5％CO 2、37ºC）内部の回転シェーカー上で混合膠細胞培養からミクログリア細胞クラスターを振り払います。 、混合グリア培養物からミクログリアを含む上清を脱いで40ミクロ​​ンの細胞ストレーナーを通してそれを渡し、滅菌50mlチューブに細胞懸濁液を保ちます。 注：ミクログリア培養物は、いくつかの汚染のOPCと非常に少数のアストロサイトと、この工程の後に、典型的には> 95％純粋です。 必要に応じて、将来のミクログリアシェイクオフのための混合グリア培養で増殖培地を交換してください。典型的には、混合グリア培養物から（1週間に1回）複数のミクログリアシェイクオフを行います。 任意選択的に、純度が高い95％のプレート100 mmのペトリ皿あたりミクログリア含有上清（ステップ4.5.2）10mlのを取得し、37ºCで30分間、細胞培養インキュベーター中でインキュベートします。のみmicroglアストロサイトとのOPCが上清中に残っている間、とりわけ、ペトリ皿に添付します。 静かに細胞培養フード内で時計回りと反時計回り（5回ずつ）ペトリ皿を振ります。吸引し、細胞培養培地を完全成長培地10mlで置き換えます。得られた小膠細胞培養物を> 98％の純度です。 DMEMで最大7日間培養ミクログリアを、1％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました。 ラットOPC /オリゴデンドロサイトの分離 高度に濃縮されたOPC培養物を1時間140 rpmで細胞培養インキュベーター（5％CO 2、37ºC）内の回転シェーカー上75cm 2のフラスコ中で増殖させ10日齢の混合グリア培養物から最初のミクログリア細胞を振り払う取得するには。ミクログリアのみ含有上清を廃棄またはミクログリア固有の実験（ステップ5.5を参照）に使用します。 10ミリリットルの成長培地とミクログリア含有上清を交換し、混合膠細胞培養を振り払います200回転（5％CO 2、37ºC）で回転シェーカー上の別の18時間。 混合グリア培養物からmicroglia-とOPC含有上清を収集し、40ミクロ​​ンの細胞ストレーナーを通過します。滅菌50mlチューブ中の細胞懸濁液を収集します。 必要に応じて、今後のOPCシェイクオフのための混合グリア培養で増殖培地を交換してください。 注：OPCには、よ​​り低い収率ではあるが、アストロサイトのフィーダー層上で増殖し続けると振とうオフすることができます第二および第三回（週1回）。 プレートmicroglia-〜100mmのペトリ皿に上清をOPC含有し、37ºCで30分間、細胞培養インキュベーター中でインキュベートし、10mlの。 OPCのとアストロサイトが上清中に残っている間ミクログリアは、ペトリ皿に添付します。 静かに細胞培養フード内で時計回りと反時計回り（5回ずつ）ペトリ皿を振ります。細胞培養インキュベーターから一度にわずか数ペトリ皿を取り出し（ミクログリアは、ペットからの脱落を開始します里料理クーラー培地中で激しく振とう）。 50mlチューブでOPC含有上清を収集し、組み合わせます。必要に応じて、小膠細胞特異的実験で使用するためのペトリ皿に培地を加えます。 必要に応じて、さらにOPC培養物の純度を高めるために、OPCの準備にミクログリアの程度を下げるために、新鮮なペトリ皿で​​一回のステップ5.6.5と5.6.6を繰り返します。 250×gで、4ºCで5分間遠心分離器で濃縮されたOPC含有上清をスピンダウン。静かに細胞ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。 （10回）ペレットの上に上清の3ミリリットルを残すとフリック指でのOPCを再懸濁開始。 （ – 10倍5）10 mlピペットを用いて、ゆっくり粉薬OPC細胞クラスター。 細胞を計数し、6ウェルディッシュに400μlの増殖培地のパドル25ミリメートルのガラスカバースリップ（PDLでコーティングされた）あ ​​たり50,000のOPCをプレートし、細胞を細胞培養インキュベーター（5％CO 2、37、30分間付着させ6; C）。静かに各ウェルに暖かい増殖培地（ 表1を参照）の2ミリリットルを追加します。増殖培地の3ミリリットルで150万のOPC – PDLでコーティングされた60ミリメートル細胞培養皿、プレート1のため。 慎重に（正しく接続してくださいのOPCを行い、培地交換の際に取り除くしない）のOPCをメッキした後、新鮮な増殖培地3時間でFBS含有増殖培地を交換してください。交換媒体ごとに二日目。 注：ラットOPC培養物は、典型的には、星状細胞、続いて主要な汚染細胞型としてミクログリア90％純粋であり、このプロトコルを使用して調製。 初代グリア細胞にHIgM12を使用5.免疫細胞化学 HIgM12、抗PSAモノクローナル抗体、およびWTとNCAM KOマウスからの一次グリア細胞における細胞型特異的マーカーを使用してトリプルラベル免疫蛍光 生細胞条件下では、ラベル60％コンフルエントマウスPDL-コーティングされた上に成長させたWTおよびNCAM KOマウスからグリア培養を混合HIgM12（10μg/ ml）及びPBS中の抗PSAモノクローナル抗体（クローン2-2B）（10μg/ ml）で25ミリメートルのガラスカバースリップを30分間4ºCで、10％FBSを補充しました。 氷冷PBSで各々10％FBSを補充した20秒間細胞を3回洗浄し、25ºCで15分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド、pH7.4で固定します。 PBSで各々10％FBSを補充した1分間固定した細胞を2回洗浄し、25ºCで2分間PBS、pH7.4中の0.1％のTriton-X100で細胞を透過性。低温室で4ºCで一晩、10％FBSを補充した1分間細胞を2回洗浄し、グリアマーカーGFAP（アストロサイト）またはPBS中のIBA-1（ミクログリア）（1μg/ ml）でラベル。 DAPI含有封入剤31を含む標準的な免疫条件に進みます。 注意：人間のための二次抗体（HIgM12）およびマウス（抗PSAモノクローナル抗体、クローン2 – 2B）として使用し、蛍光のFab 2フラグメントを標識したIgMを強くお勧めします。 FLを取ります60Xまたは100Xの倍率でuorescent画像。同一のすべての画像およびプロセスイメージに対して同じ機器設定を使用します。 一次抗体としてHIgM12を使用してENDO-NF処置WTグリア細胞の免疫蛍光標識 たNeurobasal Aで3日間増殖させた培養WTマウス混合グリア細胞は、PDLコーティングされたの25mmカバーガラス上で、10％FBS及びB27サプリメント（1：50）を補充しました。 1mLの培地にENDO-NF（30μgの/ ml）を加え、細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で一晩インキュベートします。 5.1.5へのステップ5.1.1で説明したようにラベルの細胞は、固定および透過処理後HIgM12と内部アストロサイトマーカーGFAPと寒さの中に住んでいます。 60Xまたは100Xの倍率で蛍光画像を撮影します。すべての画像に同じ機器設定を使用して、同じように処理します。