Spécificité des anticorps de liaison pour Kappa (VK) humaines (IgM) contenant de chaîne légère: POLYSIALIQUE Acid (PSA) Rattaché à NCAM comme étude de cas

des protocoles et des procédures animales ont été menées en conformité avec les National Institutes of Health des lignes directrices et approuvées par le soin des animaux et de l'utilisation des comités institutionnels de la Clinique Mayo (Mayo IACUC numéro de protocole # A51912). Préparation des tissus 1. Généralités CNS Générer NCAM déficient (KO) souris sur C57 / BL6 fond (aimablement fourni par le Dr Lynn Landmesser, Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio), les souris hétérozygotes NCAM et de type sauvage (WT) littermates (C57 / BL6) en traversant les hétérozygotes. Génotypage des souris KO NCAM a été décrite précédemment et 32 à 34 ne sera pas expliqué plus en détail. Note: les étapes 01.02 à 01.06 sont en option. Avant la chirurgie, administrer une solution de pentobarbital (Stock: 25 mg / ml; 50/100 pi de pentobarbital pour les premiers stades adultes respectifs postnatales) par injection intrapéritonéale (aiguille de calibre 27 et 1 mlseringue). Attendre 2 min ou jusqu'à ce que l'animal a atteint un plan chirurgical de l'anesthésie. Administrer un anesthésique supplémentaire, si nécessaire, au cours de chaque opération pour maintenir un plan chirurgical de l'anesthésie. Utiliser la méthode de pincement réponse toe pour déterminer la profondeur de l'anesthésie. Les animaux doivent être insensible avant de continuer. Faire 0,5 – incision latérale 1 cm à travers le tégument et la paroi abdominale juste au-dessous de la cage thoracique. Séparez délicatement le foie du diaphragme. Faire une petite incision dans la membrane en utilisant une courbe, ciseaux émoussés. Continuer l'incision de la membrane sur toute la longueur de la cage thoracique afin d'exposer la cavité pleurale. Placez courbes, ciseaux émoussés le long d'un côté de la cage thoracique, déplaçant soigneusement les poumons, et faire une coupe à travers la cage thoracique jusqu'à la clavicule. Faire une coupe similaire sur le côté opposé. Soulever le sternum loin, couper avec précaution tout tissu en le connectant au cœur. Faire une incision à l'animal'S oreillette droite à l'aide d'iris ciseaux pour créer aussi grand une sortie possible. Injecter lentement 10 ml de tampon phosphate salin (PBS) dans le ventricule gauche de l'animal (rouge clair; débit: 1 ml / min) à l'aide d'une seringue de 10 ml équipé d'aiguille de calibre 27. Ne pas augmenter le débit / PBS de pression pendant la perfusion pour éviter la destruction des tissus. Décapitez souris néonatale en utilisant des ciseaux chirurgicaux. Retirez le cerveau en saisissant les orbites avec une pince et en insérant une petite paire de ciseaux dans la colonne vertébrale. Couper le crâne vers l'avant au niveau de l'oreille. Peler le crâne et placez doucement le cerveau dans un plat de 60 mm de Pétri remplie avec 10 ml de milieu de dissection glacée sur la glace (tableau 1). Placez chaque cerveau dans un tube de 1,5 ml et stocker immédiatement sur de la glace sèche (-79 ºC). Inciser le cervelet et le tronc cérébral à partir de cerveaux congelés à l'aide d'une lame de rasoir propre sur la glace. Travaillez rapidement pour éviter la décongélation du tissu. Peser lecerebrum congelés, mis dans un tube de 15 ml sur la glace et ajouter un tampon de lyse glacé (voir le tableau 1) à une concentration finale de 150 pg de tissu cérébral par ul de tampon de lyse. Répétez l'opération pour cerebra restant. Gardez le cerveau sur la glace en tout temps pour les étapes 1.9 – 1.11. Homogénéiser le cerveau dans du tampon de lyse par trituration à travers une pointe de pipette de 1 ml (10 fois), puis par trituration à travers une seringue de 5 ml équipé d'une aiguille de calibre 27 (10 fois). Laisser incuber les lysats de cerveau pendant encore 30 minutes sur de la glace pour permettre une lyse complète des tissus. Retirer matériel et le cerveau des lipides détergents insolubles par centrifugation série (quatre tours à 19.000 xg pendant 10 min à 4 ° C). Jeter (blanc) myéline et les débris cellulaires contenant des granulés tout en conservant le surnageant après chaque étape de centrifugation. Aliquotes lysats du cerveau et conserver à -80 ºC. 2. immunoprécipitations Utilisation IgM humaine (HIgM12 et Isotype contrôle IgM) en tant que "Pull-down" Agent de Cerebral lysats de WT et NCAM KO Souris Agarose L protéine Perle Préparation 9,35,36 Préparer 200 ml de tampon IP , y compris BSA (voir le tableau 1). Préparer un autre 200 ml du même tampon IP sans BSA. Par immunoprécipitation transfert de réaction de 100 pi de suspension de protéine L Agarose en utilisant une pipette de 200 pi dans un tube de 1,5 ml. Ne pas protéines vortex perles d'agarose L! Ajouter 1 ml de tampon IP (voir le tableau 1) à chaque tube. Mélanger la protéine L agarose et de tampon IP manuellement à travers l'inversion (cinq fois). Laver la protéine L billes d'agarose quatre fois par centrifugation dans une centrifugeuse de paillasse (1000 xg, 2 min, 25 ° C). Prenez le surnageant à l'aide d'une pipette de 200 pi sans perturber le culot d'agarose. Répétez les étapes de lavage 2.1.2 à 2.1.3 trois fois supplémentaires. Equilibrer la protéine L agarose dans 1 ml de tampon IP fraîchement ajouté sur un rouleau pendant une nuit à 4 ° C. Anticorps-antigène-Agarose L Formation complexe et détection d' antigène dans le Western Blot Laisser incuber 30 mg de tissu cérébral lysées (~ 200 ul de lysat) dans 1 ml de tampon IP glacé avec 20 pg d'anticorps IgM (HIgM12) dans un tube de 1,5 ml pendant une nuit sur un rouleau à 4 ° C. Isoler des billes d'agarose de protéine L (de l'étape 2.1.4) dans une centrifugeuse de paillasse pendant 2 min à 1000 xg, 4 ° C. Jeter le surnageant à l'aide d'une pipette 200 ul sans perturber le culot d'agarose. Ajouter la solution refroidie anticorps-encéphalique lysat (de l'étape 2.2.1) à la protéine L d'agarose en utilisant une pipette de 1 ml. Incuber la suspension d'agarose L anticorps-antigène-protéine pendant 2 heures sur un rouleau à 4 ° C. Laver le complexe anticorps-antigène fixé sur Agarose L par centrifugation à 1000 g pendant 2 min, 4 ° C. Eliminer délicatement le surnageant sans perturber le culot et ajouter 1 ml de tampon IP glacée contenant 0,2% de BSA. Répéter l'étape de lavage une fois de plus en utilisant un tampon IP glacé contenant 0,2% de BSA et deux fois de plus en utilisant un tampon IP glacée sans BSA. Centrifuger complexe anticorps-antigène fixé sur Agarose L à 1000 g pendant 2 min, 4 ° C. Rejeter le surnageant complètement première en utilisant une pipette de 200 pi jusqu'à ~ 50 pi de solution sont laissées sur le dessus de la pastille d'agarose protéine G suivie d'une pipette 10 ul. Conserver les échantillons sur la glace. Ajouter 40 pi de tampon d'élution IP (voir le tableau 1) par 1,5 ml microtubes, tubes flick doigt 6 fois et chaleur pendant 5 min à 95 ° C. Mettre les échantillons sur la glace pendant 2 min et centrifuger pendant 30 secondes à 13.000 xg, 4 ° C. Transférer le surnageant à l'aide d'une pipette de 10 pi (~ 35 pi au total) dans un nouveau tube de 1,5 ml sans perturber le culot. Confirmer l'absence de billes d'agarose protéine L par rinçage dans une petite quantité d'échantillon élué à la paroi intérieure du tube. Note: "Granular"la protéine L billes d'agarose sont clairement visibles si elle est présente. Si billes de protéine L d'agarose sont présents, centrifuger l'échantillon pendant 30 secondes à 13.000 xg surnageant et nettoyer le tuyau. Répétez l'étape jusqu'à ce qu'aucune billes d'agarose sont détectables. Charge 10 – 20 pi d'échantillons éluées par puits sur gel SDS-polyacrylamide dans un système de tampon Tris / Glycine / SDS (voir le tableau 1). Remarque: Utilisez 7,5% ou 4 – 20% de gels de gradient avec 50 ul de volume de chargement par puits pour la détection de PSA-NCAM ou isoformes NCAM (dimensions de gel (W x L x épaisseur: 8,6 x 6,7 x 0,1 cm). Gels Run pour ~ 1 h à 100 V (1,74 V / cm 2) sur paillasse. Un refroidissement supplémentaire est pas nécessaire pour cette étape 37,38. Les protéines de transfert de PVDF (fluorure de polyvinylidène) à membrane (taille de pores 0,45 um) pendant 2,5 heures en chambre froide à 100 V (1,74 V / cm 2) en utilisant un tampon de transfert à froid (5-10 ° C) (voir tableau 1). membranes de bloc wvec 10% (p / v) de poudre de lait en poudre dans du PBS-T pendant 1 heure à 25 ° C sur un agitateur orbital de paillasse, lavage des membranes à deux reprises pendant 10 minutes avec du PBS-T et la sonde pendant une nuit avec l'anticorps primaire dans 5% de BSA dans du PBS T sur un agitateur orbital dans la chambre froide. Le lendemain matin, les membranes de lavage une fois brièvement avec un excès de PBS-T à 25 ° C (y compris le couvercle et le récipient), suivi par 3 lavages avec du PBS-T pendant 10 minutes à chaque fois sur un agitateur orbital (80 tpm) (toutes les étapes de lavage sont effectuées à 25 ºC). Ajouter un anticorps secondaire (peroxydase de raifort (HRP) conjugué à un anticorps anti-humain anti-IgM (pour HIgM12) (dilution 1: 30 000) dans 5% de lait sec en poudre dans du PBS-T pendant 1 heure à 25 ° C sur un agitateur orbital (70 tours par minute ). membranes Laver abondamment une fois brièvement avec excès de PBS-T à 25 ºC (comprennent le couvercle et le récipient) suivi de 3 lavages avec du PBS-T pendant 10 minutes chacun sur un agitateur orbital (80 rpm) (toutes les étapes de lavage sont effectuées à 25 ° C) . Mélanger 1 ml de froid chemiluminescen amélioréCE HRP composant de substrat A (enhanced de réactif au luminol) avec 1 ml de composant B (réactif oxydant) (par mini-Blot) à 25 ° C. Utilisez une pince en plastique pour transférer les membranes sur une serviette en papier pour enlever l'excès de liquide (les tenir sur les bords mêmes). Les contenants secs avec des serviettes en papier et membranes remettre dans les conteneurs (un pour chaque membrane). Immédiatement ajouter 2 ml de substrat pré-mélangé chimioluminescence amplifiée HRP (composé A + B) (étape 2.2.16.) de chaque membrane et on incube pendant 2 min à 25 ° C sur un agitateur orbital (90 rpm). Assurez-vous que les membranes sont uniformément humidifiées par le réactif de chimiluminescence. Transfert des membranes dans un manchon en plastique transparent et enlever le liquide et les bulles d'air en excès avec des serviettes en papier. Mettez les membranes dans le manchon en plastique dans une cassette de film et, éventuellement, la bande du manchon en plastique dans la cassette. Fermez la cassette. Prenez la cassette, le cinéma, la minuterie et des ciseaux dans la chambre noire. Couper coin supérieur droit de chaque film à des fins d'orientation, exposer (différents) films pour différentes périodes de temps (10 sec, 1 min, 10 min) et de développer des films à un développeur de film. 3. Endoneuraminidase-NF Digestion de PSA attachés à NCAM 39 Digest cerveau lysées tissu de jours après la naissance (P) 7 souris WT et des souris KO P7 NCAM (préparé à partir de l' étape 1.12) pendant 2 h sur de la glace à l' aide endoneuraminidase-NF (endo-NF) comme cela est illustré dans le tableau 2 39. Ajouter 5 ul de tampon d'échantillon Laemmli 4x à chacun des tubes (1 – 6) de l' étape 3.1 (tableau 2). Charger les échantillons sur un 4 – gradient de gel et répétez SDS-polyacrylamide 20% étapes 2.2.10 à 2.2.19. Les membranes de la sonde avec HIgM12 (1 pg / ml), disponible dans le commerce anti-PSA anticorps monoclonal (clone 2-2B) (1 pg / ml) et d'anticorps (contrôle de charge) de la β-actine (1 pg / ml) dans 5% de BSA dans du PBS -T. 4. Préparation du Rat et Cultures Souris CNS <strong> Préparation du verre Lamelles Acid-lavage 25 mm lamelles de verre dans HCl 1 M à 50 – 60 ° C pendant 4-16 heures dans une hotte en utilisant un récipient en verre. Agiter lamelles de temps en temps par tourbillonnement doux. Laver abondamment dans le verre lamelles de l'eau distillée (3x). Assurez-vous de laver l'acide entre les lamelles empilées. Rinçage des lamelles dans 100% d'éthanol et de les sécher sur du parafilm dans une hotte de culture cellulaire. Un jour avant l'utilisation, chauffer les lamelles de verre pendant 24 heures dans un récipient en verre avec couvercle à 100 ° C dans un four. Mettez des lamelles de verre dans un plat à 6 puits et manteau avec 3 ml de 40 pg / ml de poly-D-lysine dans l'eau stérile pendant 1 heure à 37 ° C. Laver deux fois avec de l'eau stérile, sécher complètement sous culture cellulaire hotte et appliquer la lumière UV pendant 20 min. Préparation de la culture de tissu en plastique pour les cellules du SNC Manteau de 60 mm de boîtes de culture cellulaire ou 75 cm des flacons de culture de tissu 2 avec 3ml ml ou 10, respectivement, de 40 pg / ml de poly-D-lysine dans de l'eau stérile pendant 1 heure à 37 ° C. Laver deux fois avec de l'eau, sécher complètement sous culture cellulaire hotte et appliquer la lumière UV pendant 20 min. Rat mélangé Glia Isolation 40 Anesthetize rats nouveau – nés dans IACUC approuvé chambre de l' euthanasie des rongeurs avec du CO 2 alimentation en gaz (entièrement automatisé). Utiliser la méthode de pincement réponse toe pour déterminer l'absence de réaction de l'animal. Décapitez néonatale rat Sprague Dawley (de P0P1) (6 – 10 chiots à la fois). Retirez le cerveau en saisissant les orbites avec une pince et en insérant une petite paire de ciseaux dans la colonne vertébrale. Couper le crâne vers l'avant au niveau de l'oreille. Peler le crâne et placez doucement le cerveau dans un plat de 60 mm de Pétri remplie avec 10 ml de milieu de dissection glacée sur la glace (voir le tableau 1). Répétez pour le reste de jeunes rats (6 – 10) des chiots. Gardez le tissu sur la glace pour les étapes 4.3.2 – 4.3.7. </li> Divisez le cerveau le long de la ligne médiane en deux hémisphères cérébraux et ensuite couper les bulbes olfactifs, ganglions de la base en dessous du cortex cérébral et l'hippocampe avec une pince Dumont. Placez le cortex cérébral isolé dans un plat propre Petri contenant disséquant moyen sur la glace. Prenez un cortex. Retirez les méninges avec des pinces à pointes fines sous un microscope de dissection. Répéter l'opération avec les corticales restants. Placez tous les corticales libres-méninges dans un plat propre Petri sur de la glace. Combinez hémisphères corticaux de tous les chiots dans une boîte de Pétri de 60 mm et d'utiliser une lame de rasoir stérile dés le tissu cérébral dans 1 mm morceaux hachés. Transférer le tissu cérébral haché à l'aide d'une pipette de 10 ml dans un non enrobé de 500 ml, flacon en verre stérile et on ajoute 10 ml de milieu de dissection glacée par le cerveau de rat. agiter doucement le flacon tout en ajoutant 1 ml de solution de trypsine dans du HBSS (solution saline équilibrée de Hank) (5 mg / ml de trypsine) à 9 ml de HBSS par le cerveau de rat. Ajouter 2% Du volume total de la solution de DNase I (1 mg / ml) et 2% du volume total MgSO4 solution (3,82% de MgSO4 dans HBSS (p / v)) pour la suspension de tissu cérébral et agiter doucement. Trypsiniser tissu sous agitation douce sur un agitateur rotatif pendant 30 min à 37 ° C. Assurez-vous que les morceaux de tissu flottent au cours de cette étape et ne sédimentent pas au fond. Augmenter la vitesse de rotation si nécessaire. Ajouter du sérum bovin fœtal (FBS) à une concentration finale de 10% (v / v) et mélanger en agitant le ballon 10 fois pendant 10 s. Refroidir suspension de tissu dans l'eau glacée pendant 15 minutes. Swirl flacon doucement cinq fois par seconde min. transférer doucement la suspension de tissu dans 50 ml tubes stériles en utilisant 25 ml ou 50 ml pipettes et centrifuger pendant 5 min à 200 xg, 4 ° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension doucement le tissu du SNC digéré dans 15 ml de milieu de dissection glacée additionnée de 5 ml de sérum fœtal bovin, 0,4 ml de MgSO4 solution (3,82%MgSO4 dans HBSS) et 1,6 ml de DNase I (1 mg / ml). suspension de tissu de Split également en deux stériles tubes de 15 ml (~ 10 ml chacun) et lentement triturer à l'aide d'une pipette de 10 ml (10 fois) jusqu'à ce que la suspension devient turbide / laiteux. Gardez les cellules en suspension sur la glace lors du traitement du tube suivant. Attendre pendant 3 minutes jusqu'à ce que les tissus du système nerveux central digérée restante des sédiments au fond du tube. Transférer le surnageant à nettoyer 50 ml tube sans perturber la fraction de culot. En option, passer surnageants turbides à 40 microns tamis cellulaire et de combiner la suspension cellulaire unique résultant en tubes de 50 ml stériles sur la glace. Spin suspension cellulaire pendant 5 min à 200 xg, 4 ° C. Retirez délicatement le surnageant en utilisant une pipette de 10 ml jusqu'à ~ 2 ml de dissection moyen sont laissés sur le dessus du culot cellulaire. Finger culots de cellules de film dans 50 ml tubes (~ 10 fois). Ajouter lentement 5 ml de milieu de croissance chaud (voir le tableau 1) à la suspension cellulaire tout en douceurmain tourbillonnant le tube. En option, répéter DNase étape 4.3.12 pour 10 minutes de plus sur la glace avec une solution de DNase I fraîche et MgSO 4 -solution en cas d'amas de tissus visibles ou des touffes d'ADN. Tube Swirl manuellement 5 fois par seconde min. Plaque de 50.000 cellules par 25 mm lamelle de verre dans une flaque d' eau de 400 milieu de croissance ul dans un plat à 6 puits et laisser les cellules se fixent pendant 30 min dans un incubateur de culture cellulaire (5% de CO 2, 37 ° C). Pour les confluents ( à moins de 24-48 heures après placage) 60 mm des boîtes de culture cellulaire et tissulaire de 75 cm2 de flacons de culture, la plaque 500000 cellules (boîte de 60 mm) ou de 2 millions de cellules (flacons de 75 cm2). Ajouter délicatement 2 ml (par puits, des lamelles de verre de 25 mm dans un plat à 6 puits), 3 ml (plats 60 mm) ou 10 ml (75 cm 2 flacons) de milieu de croissance chaud à chaque puits. Incuber les cellules pendant la nuit et changer moyen complètement le lendemain matin. Puis changer moyen tous les autres jours (jour 3, jour 5, jour 7, etc.). Nonte: Rat cultures gliales mixtes sont prêts à utiliser pour immunocytochimie ou biochimie 24-48 heures après placage. Cultures Souris mixte gliales Identique à la dissection des cerveaux de rats nouveau – nés décrits dans les sections 4.3.1 à 4.3.6, décapite P0 néonatales souris WT et NCAM KO avec C57 / BL6 fond, retirer les cerveaux et les mettre dans un milieu de dissection glacée (voir Tableau 1). Gardez le tissu sur la glace en tout temps. Divisez le cerveau le long de la ligne médiane en deux hémisphères cérébraux et ensuite couper les bulbes olfactifs, ganglions de la base en dessous du cortex cérébral et l'hippocampe avec une pince Dumont. Placez le cortex cérébral isolé dans un plat propre Petri contenant HBSS sur la glace. Prenez un cortex. Retirez les méninges avec des pinces à pointes fines sous un microscope de dissection. Répéter l'opération avec les corticales restants. Placez tous les corticales libres-méninges dans un plat propre Petri sur de la glace. Transfert hemisphe corticaleres avec pipette de 1 ml de chaque souris dans, stériles 15 ml tubes séparés. Ajouter 1,2 ml de milieu de dissection glacée pour chaque cerveau et perturber mécaniquement le tissu cérébral par pipetage il 2 fois haut et en bas à l'aide d'une pipette de 1 ml. Ajouter 150 ul de solution de papaïne (10 mg / ml dans du PBS), 100 ul de solution de DNase I (1 mg / ml dans du HBSS) et 50 ul de MgSO4 (3,82% dans HBSS) pour chaque cerveau et mélanger en tapotant un doigt. Incuber la suspension du cerveau pendant 30 min à 37 ° C dans un bain d'eau et mélanger des suspensions de cerveau toutes les deux minutes par le doigt chiquenaude. Ajouter 1 ml de FBS par tube, mélanger et refroidir la suspension de tissu pendant 10 minutes sur la glace. Centrifuger le tissu cérébral pendant 4 min à 200 x g, 4 ° C et remettre en suspension le culot de tissu dans 1 ml de tampon de dissection glacé additionné de 70 ul de désoxyribonucléase I solution (1 mg / ml dans du HBSS) et 30 ul MgSO4 solution (3,82% dans HBSS). Triturer le tissu cérébral en utilisant un FBS revêtu 1 ml pointe de la pipette(~ 5 fois) jusqu'à ce que le surnageant devient turbide. Passez le surnageant à travers un tamis cellulaire de 40 microns et transférer dans un tube propre sur la glace. Pellet cellules gliales mixtes par centrifugation pendant 5 min à 200 xg, 4 ° C. Aspirer le surnageant jusqu'à ~ 100 ul de milieu sont laissées sur le dessus du culot cellulaire. Resuspendre culot cellulaire par le doigt effleurant (~ 5 fois) et ajouter 1 ml de milieu de croissance de la souris chaude (voir le tableau 1). Le cas échéant, dissoudre les agrégats de cellules visibles et les cellules lysées / précipite l'ADN par pipetage la suspension cellulaire vers le haut et vers le bas (cinq fois). Plate souris cellules gliales mixtes sur des lamelles de verre PDL revêtus ou plats de 60 mm, comme décrit dans les étapes 4.3.19 – 4.3.21. Laver les cellules le lendemain matin avec un milieu de croissance de la souris chaude et ensuite tous les autres jours. Souris glie mixte est prêt à utiliser pour immunocytochimie 48-72 heures après placage. Rat Microglia Isolation Culture rat mélangéglie dans 75 cm 2 flacons de culture tissulaire dans un milieu de croissance (voir le tableau 1) pendant 10 jours. Secouez amas de cellules microgliales de cultures mixtes gliales sur un agitateur rotatif à l' intérieur d' un incubateur de culture cellulaire (5% de CO 2, 37 ° C) à 140 tours par minute pendant 1 heure. Enlever le surnageant contenant microglie-de cultures gliales mixtes, passer à travers un tamis cellulaire de 40 microns et maintenir la suspension de cellules dans 50 ml tubes stériles. Nota: Les cultures microgliales sont généralement> 95% de pureté après cette étape avec peu CPOs contaminantes et très peu d'astrocytes. Eventuellement, remplacer le milieu de croissance sur les cultures gliales mixtes pour les futurs bouleversements offs microgliales. Typiquement effectuer plusieurs secousses-offs microgliales (une fois par semaine) à partir de cultures mixtes gliales. Le cas échéant, pour obtenir des puretés supérieur à 95% plaque de 10 ml du liquide surnageant contenant la microglie (étape 4.5.2) par 100 mm de boîtes de Petri et on incube dans un incubateur de culture cellulaire pendant 30 min à 37 ° C. Seulement microglia joindra à des boîtes de Pétri, tandis que les astrocytes et les OPCs restent dans le surnageant. Secouer doucement les boîtes de Pétri droite et à gauche (cinq fois chacun) dans la hotte de culture cellulaire. Aspirer le milieu de culture cellulaire remplacer complètement et avec 10 ml de milieu de croissance. Résultant des cultures de microglie sont> 98% pure. microglie de la culture pendant 7 jours dans du DMEM supplémenté avec 1% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine. Rat OPC / oligodendrocytes Isolation Pour obtenir des cultures OPC hautement enrichi secouer les cellules microgliales première de 10 jours vieilles cultures mixtes gliales cultivées dans 75 cm 2 flacons sur un agitateur rotatif dans un incubateur de culture cellulaire (5% de CO 2, 37 ° C) à 140 tours par minute pendant 1 heure. Jeter les microglies ne contenant surnageant ou utiliser pour des expériences spécifiques à la microglie (voir étape 5.5). Remplacer le surnageant contenant la microglie-avec un milieu de croissance de 10 ml et secouer les cultures gliales mixtes pourun autre 18 heures sur un agitateur rotatif à 200 tpm (5% de CO 2, 37 ° C). Recueillir le microglia- et le surnageant contenant OPC à partir de cultures gliales mixtes et passer à travers un tamis cellulaire de 40 microns. Recueillir la suspension cellulaire dans des tubes stériles de 50 ml. Eventuellement, remplacer le milieu de croissance sur les cultures gliales mixtes pour OPC futures secousses-offs. Note: OPCs continuent de proliférer sur des couches nourricières astrocytaires et peuvent être ébranlées-off une deuxième et une troisième fois (une fois par semaine), mais avec des rendements plus faibles. Plaque 10 ml de microglia- et OPC contenant un surnageant dans des boîtes de Petri de 100 mm et incuber dans l'incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes à 37 ° C. La microglie joindra aux boîtes de Petri, tandis que les OPC et les astrocytes restent dans le surnageant. Secouer doucement les boîtes de Pétri droite et à gauche (5 fois chacun) dans une hotte de culture cellulaire. Sortez seulement quelques boîtes de Pétri à la fois de la culture cellulaire incubateur (microglie va commencer délogeant de Petplats ri quand on les secoue vigoureusement dans un milieu plus frais). Recueillir et combiner le surnageant contenant OPC en tubes de 50 ml. En option, ajouter un milieu de culture à des boîtes de Pétri pour une utilisation dans des expériences spécifiques à la microglie. Eventuellement, pour augmenter encore la pureté des cultures OPC répéter les étapes 5.6.5 et 5.6.6 une fois avec des plats frais de Pétri pour réduire l'ampleur de la microglie dans les préparations OPC. Isoler enrichi surnageant contenant OPC dans la centrifugeuse pendant 5 min à 250 xg, 4 ° C. Aspirer doucement le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Laisser 3 ml du surnageant au-dessus de la pastille et commencer la remise en suspension par OPCs doigt pichenette (10 fois). Broyez doucement OPC amas de cellules en utilisant une pipette de 10 ml (5 – 10 fois). Compter les cellules et la plaque 50.000 OPCs par 25 mm lamelle de verre (PDL-enduit) dans une flaque de milieu de croissance de 400 ul dans un plat à 6 puits et laisser les cellules se fixent pendant 30 min dans un incubateur de culture cellulaire (5% de CO 2, 376; C). Ajouter délicatement 2 ml de milieu de prolifération chaude (voir le tableau 1) à chaque puits. PDL revêtu des boîtes de culture cellulaire de 60 mm, la plaque 1 – 1500000 OPCs dans 3 ml de milieu de prolifération. remplacer soigneusement FBS contenant milieu de prolifération avec un milieu de prolifération frais 3 h après étalement des OPCs (assurez-vous que les OPC attachés correctement et ne déloge pas pendant le changement moyen). milieu d'échange tous les deux jours. Note: cultures Rat OPC préparés en utilisant ce protocole sont généralement pur à 90% avec la microglie comme le principal type de cellules contaminantes, suivie par les astrocytes. 5. Immunocytochimie Utilisation HIgM12 dans les cellules gliales primaires Immunofluorescence Triple-étiquette en utilisant HIgM12, anti-PSA mAb, et le type de cellules marqueurs spécifiques dans les cellules gliales primaires de WT et NCAM KO Souris Dans des conditions de cellules vivantes, l'étiquette 60% confluentes souris mélangé cultures gliales de souris WT et NCAM KO cultivées sur PDL-enduit25 mm, les lamelles de verre avec HIgM12 (10 pg / ml) et un mAb anti-PSA (clone 2-2B) (10 pg / ml) dans du PBS additionné de FBS à 10% à 4 ° C pendant 30 min. Laver les cellules à trois reprises pendant 20 secondes chacun avec du PBS glacé supplémenté avec 10% de FBS et fixer avec 4% de paraformaldehyde dans du PBS, pH 7,4 pendant 15 min à 25 ° C. Laver les cellules fixées à deux reprises pendant 1 min chacun avec du PBS supplémenté avec 10% de FBS et perméabiliser les cellules avec 0,1% de Triton X100 dans du PBS, pH 7,4 pendant 2 min à 25 ° C. Laver les cellules deux fois pendant 1 min et l'étiquette avec des marqueurs gliales GFAP (astrocytes) ou IBA-1 (microglie) (1 pg / ml) dans du PBS additionné de 10% de FBS pendant une nuit à 4 ° C dans la chambre froide. Procéder à des conditions d'immunofluorescence standard , y compris DAPI milieu contenant 31 montage. Note: L' utilisation de Fab marqué par fluorescence 2 fragments que des anticorps secondaires pour l' homme (HIgM12) et la souris (anti-PSA mAb, clone 2 – 2B) IgM est fortement recommandé. Prenez flimages uorescentes à 60X ou 100X. Utilisez les mêmes réglages de l'appareil pour toutes les images et les images de processus identique. Immunofluorescence Étiquetage des ENDO-NF-traitées cellules WT Glie utilisant HIgM12 comme un anticorps primaire La culture WT souris mélangé glie cultivé pendant 3 jours dans un Neurobasal additionné de 10% de FBS et B27 complément (1:50) sur PDL revêtues de 25 mm, les lamelles de verre. Ajouter ENDO-NF (30 pg / ml) à 1 ml de milieu de culture et mettre à incuber pendant une nuit dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% CO 2). cellules d'étiquetage vivent dans le froid avec HIgM12 interne et astrocytaire marqueur GFAP après fixation et perméabilisation comme décrit dans les étapes 5.1.1 à 5.1.5. Prenez des images fluorescentes à 60X ou 100X. Utilisez les mêmes réglages de l'appareil pour toutes les images et traiter de manière identique.