Antilichaam bindende specificiteit voor Kappa (VK-) lichte keten bevattende de Mens (IgM) antilichamen: Polysialic Acid (PSA) Gehecht aan NCAM als Case Study

Animal protocollen en procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen en door de Mayo Clinic de institutionele dierlijke zorg en het gebruik commissies (Mayo IACUC protocol nummer # A51912) goedgekeurd. 1. Algemeen CNS Tissue Voorbereiding Genereer NCAM deficiënte (KO) muizen op C57 / Bl6 achtergrond (vriendelijk verschaft door Dr. Lynn Landmesser, Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio), heterozygote NCAM muizen en wild type (WT) nestgenoten (C57 / Bl6) door het kruisen van heterozygoten. Genotypering van NCAM KO muizen eerder beschreven 32-34, niet nader toegelicht. Opmerking: Stappen 1,2-1,6 zijn optioneel. Voor de ingreep, dienen een pentobarbital oplossing (voorraad 25 mg / ml; 50/100 pl pentobarbital voor vroege postnatale respectievelijke adulte) via intraperitoneale injectie (27 gauge naald en 1 mlspuit). Wacht 2 minuten of totdat het dier een chirurgische vlak van anesthesie bereikt. Dien extra verdoving nodig tijdens elke operatie een chirurgische vlak van anesthesie te handhaven. Gebruik teen knijpen-response methode om de diepte van de anesthesie te bepalen. De dieren mogen niet reageren voordat u verder zijn. Maak een 0,5-1 cm laterale incisie door de omhulling en buikwand net onder de ribbenkast. Zorgvuldig scheiden van de lever van het middenrif. Voeg een kleine incisie in het membraan met een gebogen stompe schaar. Verdere membraan incisie langs de gehele lengte van de ribbenkast naar de borstholte bloot te leggen. Plaats gebogen, stompe schaar langs één zijde van de ribbenkast, nauwkeurig verplaatsen van de longen, en een snede door de ribbenkast tot aan het sleutelbeen. Maak een soortgelijke bezuinigen op de contralaterale zijde. Het opheffen van het borstbeen weg, zorgvuldig trimmen elk weefsel aan te sluiten op het hart. Een insnijding aan het dier'S rechter atrium met behulp van iris schaar om zo groot een stopcontact mogelijk te maken. Injecteer langzaam 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in linker ventrikel van het dier (lichtrood; stroomsnelheid: 1 ml / min) met behulp van een 10 ml spuit met 27-gauge naald. Gebruik de druk / PBS stroom niet verhogen tijdens de perfusie om weefsel vernieling te vermijden. Onthoofden neonatale muizen met chirurgische schaar. Verwijder de hersenen door grijpen de oogkassen met een pincet en door toevoeging van een kleine schaar in de wervelkolom. Snijd de schedel naar de voorkant op oorhoogte. Trek de schedel en plaats voorzichtig de hersenen in een 60 mm petrischaal gevuld met 10 ml ijskoud medium dissectie op ijs (tabel 1). Plaats elke hersenen in een 1,5 ml microcentrifugebuis en onmiddellijk slaan op droog ijs (-79 ° C). Incise de kleine hersenen en de hersenstam uit bevroren hersenen met een schone scheermesje op ijs. Werk snel om te voorkomen dat het ontdooien van het weefsel. Weeg debevroren hersenen, in een 15 ml buis op ijs en voeg ijskoude lysisbuffer (zie tabel 1) tot een eindconcentratie van 150 ug hersenweefsel per ul lysisbuffer. Herhaal dit voor de resterende cerebra. Houd hersenen op ijs te allen tijde voor de stappen die 1,9-1,11. Homogeniseren hersenen in lysisbuffer door trituratie door middel van een 1 ml pipet tip (10 keer), gevolgd door tritureren door een 5 ml spuit uitgerust met een 27-gauge naald (10 keer). Incubeer hersenen lysaten gedurende nog 30 minuten op ijs om volledige lysis weefsel mogelijk. Verwijderen detergens-onoplosbaar materiaal en hersenlipiden via seriële centrifugatie (vier ronden bij 19.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C). Teruggooi (wit) myeline en celafval bevatten pellet maar behouden het supernatant na elke centrifugeren stap. Aliquot hersenen lysaten en bewaar bij -80 ºC. 2. Immunoprecipitaties Met behulp van Human IgM's (HIgM12 en isotype controle IgM) als een "Pull-down" Agent van Cerebral Lysaten van WT en NCAM knock-out muizen Eiwit L Agarose Bead Voorbereiding 9,35,36 Bereid 200 ml IP buffer zoals BSA (zie tabel 1). Bereid je nog eens 200 ml van hetzelfde IP-buffer zonder BSA. Per immunoprecipitatie reactie overdracht 100 ul Proteïne L agarose suspensie met behulp van een 200 gl pipet in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Niet vortex eiwit L agarosekralen! Voeg 1 ml van IP buffer (zie tabel 1) aan elke buis. Meng Eiwit L agarose en IP-buffer handmatig door middel van inversie (vijf keer). Wash eiwit L agarosekralen vier keer door centrifugeren in een benchtop centrifuge (1000 xg, 2 min, 25 ºC). Opstijgen supernatant met behulp van een 200 ul pipet zonder de agarose pellet. Herhaal wasstappen 2.1.2 tot 2.1.3 nog driemaal. Equilibreren eiwit L agarose in 1 ml vers toegevoegde IP buffer op een rollenbank gedurende de nacht bij 4 ° C. Antilichaam-antigeen-Agarose L Complex Vorming en Antigen Detection in Western Blots Incubeer 30 mg gelyseerd hersenweefsel (~ 200 ul lysaat) in 1 ml ijskoude IP buffer met 20 ug IgM antilichaam (HIgM12) in een 1,5 ml microcentrifugebuis overnacht op een wals bij 4 * C. Spin down eiwit L agarose korrels (van stap 2.1.4) in een benchtop centrifuge gedurende 2 min bij 1000 x g, 4 ° C. Verwijder het supernatant met een pipet 200 ul zonder de agarose pellet. Voeg de gekoelde antilichaam-brain lysaatoplossing (uit stap 2.2.1) het eiwit L agarose met een 1 ml pipet. Incubeer de antilichaam-antigen-eiwit L agarose suspensie gedurende 2 uur op een wals bij 4 * C. Was het antilichaam-antigeen complex gekoppeld aan L agarose door middel van centrifugatie bij 1000 g gedurende 2 min, 4 ° C. gooi voorzichtig de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren en voeg 1 ml ijskoude IP buffer met 0,2% BSA. Herhaal de wasstap nog een keer met behulp van ijskoude IP buffer met 0,2% BSA en twee extra keer met behulp van ijskoude IP buffer zonder BSA. Spin down antilichaam-antigen complex gekoppeld aan L agarose bij 1000 g gedurende 2 min, 4 ° C. Gooi supernatant eerst geheel met een 200 ul pipet tot ~ 50 pi oplossing overblijven boven het eiwit L agarose pellet gevolgd door een 10 ul pipet. Houd de monsters op ijs. Voeg 40 ul van IP elutiebuffer (zie tabel 1) per 1,5 ml microcentrifugebuizen, vinger flick tubes 6 keer en verwarm gedurende 5 minuten bij 95 ° C. Zet monsters op ijs gedurende 2 minuten en spinnen gedurende 30 sec bij 13.000 x g, 4 ° C. Transfer supernatant met een pipet 10 ui (~ 35 pi totaal) in een schoon 1,5 ml microcentrifugebuis zonder de pellet te verstoren. Bevestigen afwezigheid Proteïne L agarose korrels door spoelen in een kleine hoeveelheid geëlueerde monster aan de binnenste buiswand. Let op: "Granular"eiwit L agarose korrels duidelijk zichtbaar indien aanwezig. Als eiwit L agarosekorrels aanwezig zijn, spin down sample nog 30 sec bij 13.000 xg en overdragen supernatant aan de buis te reinigen. Herhaal stap totdat er geen agarose korrels worden gedetecteerd. Laad 10-20 ui geëlueerde monsters per putje op SDS-polyacrylamidegel in Tris / Glycine / SDS buffer (zie tabel 1). Opmerking: Gebruik 7,5% of 4-20% gradiënt gels met 50 gl per putje laadvolume voor de detectie van PSA-NCAM of NCAM isovormen (gel afmetingen (B x L x dikte: 8,6 x 6,7 x 0,1 cm). Run gels ~ 1 uur bij 100 V (1,74 V / cm 2) op benchtop. Extra koeling is niet vereist voor deze stap 37,38. Transporterende eiwitten op PVDF (polyvinylideenfluoride) membraan (poriegrootte 0,45 pm) gedurende 2,5 uur in de koude kamer bij 100 V (1,74 V / cm 2) met koud transferbuffer (5-10 ° C) (zie tabel 1). Block membranen wi 10% (w / v) droge melkpoeder in PBS-T gedurende 1 uur bij 25 ° C op een benchtop orbitaalschudder, wassen membranen tweemaal gedurende 10 min met PBS-T en probe overnacht met primair antilichaam in 5% BSA in PBS T op een orbitale schudder in de koude kamer. De volgende ochtend wasbeurt membranen eenmaal kort met overmaat PBS-T bij 25 ° C (inclusief deksel en houder) gevolgd door 3 wassingen met PBS-T gedurende 10 minuten elk op een schudapparaat (80 rpm) (alle wasstappen worden uitgevoerd bij 25 ºC). Voeg secundair antilichaam (mierikswortel peroxidase (HRP) geconjugeerd anti-humaan anti-IgM antilichaam (voor HIgM12) (verdunning 1: 30.000) in 5% droge melkpoeder in PBS-T gedurende 1 uur bij 25 ° C op een schudapparaat (70 rpm ). Wassen membranen uitvoerig eenmaal kort met overmaat PBS-T bij 25 ° C (inclusief deksel en houder) gevolgd door 3 wassingen met PBS-T gedurende 10 minuten elk op een schudapparaat (80 rpm) (alle wasstappen worden uitgevoerd bij 25 ° C) . Meng 1 ml koud verbeterde chemiluminescence HRP substraat component A (luminol versterkte reagens) met 1 ml van component B (oxidatiemiddel) (per mini blot) en 25 ° C. Gebruik plastic tang om de membranen te dragen op een papieren handdoekje om overtollige vloeistof te verwijderen (houd ze op de zeer randen). Vochtdozen met keukenpapier en zet membranen terug in de houders (één per membraan). Onmiddellijk Voeg 2 ml van de voorgemengde versterkte chemiluminescentie HRP substraat (verbinding A + B) (stap 2.2.16.) Aan elk membraan en incubeer gedurende 2 minuten bij 25 ° C op een schudapparaat (90 rpm). Zorg ervoor dat membranen gelijkmatig bevochtigd door de chemiluminescentie reagens. Transfer membranen in een doorzichtige plastic hoes en verwijder overtollige vloeistof en luchtbellen met keukenpapier. Zet membranen in plastic hoes in een filmcassette en uiteindelijk tape de kunststof huls in de cassette. Sluit de cassette. Neem de cassette, film, timer en een schaar in de donkere kamer. Snijd rechter bovenhoek van elk film ter oriëntatie, bloot (verschillende) films voor verschillende perioden (10 sec, 1 min, 10 min) en films in een film ontwikkelaar ontwikkelen. 3. Endoneuraminidase-NF Digestie van PSA Gehecht aan NCAM 39 Digest gelyseerd hersenweefsel van postnatale dag (P) 7 WT-muizen en P7 NCAM KO muizen (bereid uit stap 1,12) gedurende 2 uur op ijs met behulp endoneuraminidase-NF (ENDO-NF) zoals geïllustreerd in tabel 2 39. Voeg 5 ul van 4x Laemmli monster buffer aan elke buis (1-6) uit stap 3.1 (tabel 2). Load monsters op een 4-20% gradiënt SDS-polyacrylamidegel en herhaal stap 2.2.10 tot 2.2.19. Probe membranen HIgM12 (1 ug / ml), in de handel verkrijgbare anti-PSA-mAb (kloon 2-2B) (1 ug / ml) en β-actine antilichaam (laadcontrole) (1 ug / ml) in 5% BSA in PBS -T. 4. Voorbereiding van de Rat en Muis CNS Cultures <strong> Voorbereiding van Glass Coverslips Acid-wash 25 mm dekglaasjes in 1 M HCl bij 50 – 60 ºC voor 4-16 uur in een zuurkast met een glazen container. Schud dekglaasjes zo nu en dan door middel van zachte zwenken. Was de dekglaasjes uitgebreid in gedestilleerd water (3x). Zorg ervoor te wassen uit het zuur tussen de gestapelde dekglaasjes. Spoel dekglaasjes in 100% ethanol en droog ze op Parafilm in een celkweek kap. Een dag voor gebruik, verwarm de dekglaasjes gedurende 24 uur in een glazen bak met deksel bij 100 ° C in een oven. Zet dekglaasjes in 6-putjes en jas met 3 ml van 40 ug / ml poly-D-lysine in steriel water gedurende 1 uur bij 37 ° C. Was tweemaal met steriel water, droog volledig onder celcultuur motorkap en toe te passen UV-licht gedurende 20 minuten. Voorbereiding van de Tissue Culture Plastic voor CNS Cells Coat 60 mm celkweek gerechten of 75 cm 2 weefselkweek kolven met 3ml of 10 ml van respectievelijk 40 ug / ml poly-D-lysine in steriel water gedurende 1 uur bij 37 ° C. Was tweemaal met water, droog volledig onder celcultuur motorkap en toe te passen UV-licht gedurende 20 minuten. Rat gemengd Glia Isolation 40 Verdoven neonatale ratten in IACUC goedgekeurd knaagdier euthanasie kamer met CO 2 gastoevoer (volledig geautomatiseerd). Gebruik teen knijpen-response methode om ongevoeligheid van het dier te bepalen. Onthoofden neonatale Sprague Dawley rat (P0P1) (6 – 10 pups per keer). Verwijder de hersenen door grijpen de oogkassen met een pincet en door toevoeging van een kleine schaar in de wervelkolom. Snijd de schedel naar de voorkant op oorhoogte. Trek de schedel en plaats voorzichtig het brein in een 60 mm petrischaal gevuld met 10 ml ijskoude ontleden medium op ijs (zie tabel 1). Herhaal dit voor de resterende jonge ratten (6-10 pups). Houd weefsel op het ijs voor de stappen 4.3.2 – 4.3.7. </li> Verdeel de grote hersenen over de middellijn in twee hersenhelften en vervolgens afgesneden olfactorische bollen, basale ganglia onder de cerebrale cortex en de hippocampus met Dumont tang. Plaats de geïsoleerde cerebrale cortex in een schone petrischaal met het ontleden van medium op ijs. Neem een ​​cortex. Verwijder de hersenvliezen met een pincet met fijne tips onder een dissectie microscoop. Herhaal dit met de resterende cortex. Plaats alle hersenvliezen-vrije cortex in een schone petrischaal op ijs. Combineer corticale halfrond uit alle pups in een 60 mm petrischaal en het gebruik van een steriel scheermesje om het hersenweefsel snijd in 1 mm gehakt stukken. Breng het gehakt hersenweefsel met behulp van een 10 ml pipet in een steriele, ongestreken 500 ml glazen kolf en voeg 10 ml van ijskoude ontleden medium per hersenen van de rat. Zwenk de kolf tijdens het toevoegen van 1 ml trypsine-oplossing in HBSS (Hank's gebalanceerde zoutoplossing) (5 mg / ml trypsine) om 9 ml HBSS per rattenhersenen. Voeg 2% Van het totale volume DNase I-oplossing (1 mg / ml) en 2% van het totale volume MgSO4-oplossing (3,82% MgSO 4 in HBSS (w / v)) om het hersenweefsel suspensie en schud zachtjes. Trypsinize weefsel onder voorzichtig schudden op een roterende schudder gedurende 30 min bij 37 ° C. Controleer weefselstukjes zweeft tijdens deze stap en niet sedimenteren op de bodem. Verhoog de draaisnelheid indien nodig. Voeg foetaal runderserum (FBS) tot een eindconcentratie van 10% (v / v) en meng door omzwenken 10 keer gedurende 10 sec. Afkoelen weefsel suspensie in ijswater gedurende 15 minuten. Swirl kolf voorzichtig vijf keer per seconde min. Zacht overdracht het weefsel suspensie in steriele 50 ml buizen ter 25 ml of 50 ml pipetten en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g, 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer voorzichtig gedigereerd CZS-weefsel in 15 ml ijskoude ontleden medium aangevuld met 5 ml foetaal runderserum, 0,4 ml MgSO4-oplossing (3,82%MgSO 4 in HBSS) en 1,6 ml DNase I (1 mg / ml). Split weefsel schorsing even in twee steriele 15 ml buizen (~ 10 ml elk) en langzaam fijnstampen met behulp van een 10 ml pipet (10 maal) tot de schorsing troebel / melkachtig. Houd gesuspendeerde cellen op ijs bij het verwerken van de volgende buis. Wacht 3 minuten tot overige gedigereerd CNS weefsels sediment op de bodem van de buis. Overdracht supernatant 50 ml tube reinigen zonder de pelletfractie. Optioneel passeren troebele supernatanten door middel van 40-micron cel zeef en combineer de resulterende enkele celsuspensie in steriele 50 ml buizen op ijs. Spin celsuspensie gedurende 5 minuten bij 200 x g, 4 ° C. Verwijder het supernatant met behulp van een 10 ml pipet tot ~ 2 ml ontleden medium overblijven bovenop de celpellet. Vinger flick cel pellets in 50 ml buizen (~ 10 keer). Voeg langzaam 5 ml warm groeimedium (zie tabel 1) aan de celsuspensie onder zachtde hand wervelende de buis. Eventueel herhalen DNase stap 4.3.12 voor een extra 10 minuten op ijs met verse DNase I-oplossing en MgSO4-oplossing in het geval van zichtbare weefsel clusters of DNA klonten. Swirl buis handmatig 5 keer per seconde min. Plaat 50.000 cellen per 25 mm dekglaasje in een plas 400 pl groeimedium in een 6-putjes en liet de cellen hechten gedurende 30 min in een celkweek incubator (5% CO2, 37 ° C). Voor confluent (binnen 24 – 48 uur na plating) 60 mm celkweek gerechten en 75 cm 2 weefselkweek kolven, plaat 500.000 cellen (60 mm gerecht) of 2 miljoen cellen (75 cm 2 flessen). Voorzichtig Voeg 2 ml (per putje, 25 mm glazen dekglaasjes in 6-putjes), 3 ml (60 mm schalen) of 10 ml (75 cm 2 flessen) warm groeimedium aan elk putje. Incubeer cellen 's nachts en verander medium volledig de volgende ochtend. Dan veranderen medium elke andere dag (dag 3, dag 5, dag 7, etc.). Neete: Rat gemengde glia culturen zijn klaar om te gebruiken voor immunocytochemie of biochemie 24 – 48 uur na plating. Mouse Mixed glialculturen Identiek aan de dissectie van de neonatale rattenhersenen is omschreven in artikel 4.3.1 tot 4.3.6, onthoofden P0 neonatale WT en NCAM knock-out muizen met C57 / Bl6 achtergrond, verwijderen hersenen en zet ze in ijskoud dissectie medium (zie tabel 1). Blijf weefsel op ijs te allen tijde. Verdeel de grote hersenen over de middellijn in twee hersenhelften en vervolgens afgesneden olfactorische bollen, basale ganglia onder de cerebrale cortex en de hippocampus met Dumont tang. Plaats de geïsoleerde cerebrale cortex in een schone petrischaal met HBSS op ijs. Neem een ​​cortex. Verwijder de hersenvliezen met een pincet met fijne tips onder een dissectie microscoop. Herhaal dit met de resterende cortex. Plaats alle hersenvliezen-vrije cortex in een schone petrischaal op ijs. Transfer corticale hemispheres met 1 ml pipet uit elke muis in afzonderlijke, steriele 15 ml buizen. Voeg 1,2 ml ijskoude ontleden medium aan elke hersenen en mechanisch verstoren het hersenweefsel te pipetteren 2 maal op en neer met een 1 ml pipet tip. Voeg 150 ul papaïne oplossing (10 mg / ml in PBS), 100 ul DNase I-oplossing (1 mg / ml in HBSS) en 50 gl MgSO 4 (3,82% in HBSS) aan elke hersenen en meng door de vinger te vegen. Incubeer de hersenen suspensie gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een waterbad en meng hersenen schorsingen elke tweede minuut door de vinger te vegen. Voeg 1 ml FBS per buis, mengen en afkoelen van het weefsel suspensie gedurende 10 minuten op ijs. Spin down het hersenweefsel gedurende 4 min bij 200 xg, 4 ° C en resuspendeer de weefsels pellet in 1 ml ijskoude ontleden buffer aangevuld met 70 ul DNase I-oplossing (1 mg / ml in HBSS) en 30 gl MgSO4 oplossing (3,82% in HBSS). Vermaal het hersenweefsel met een FBS-gecoate 1 ml pipetpunt(~ 5 maal) totdat de bovenstaande vloeistof troebel wordt. Passeer de bovenstaande vloeistof door een 40-micron cel zeef en breng in een schone buis op ijs. Pellet gemengde gliale cellen door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 200 x g, 4 ° C. Aspiraat supernatant tot ~ 100 ul medium overblijven bovenop de celpellet. Resuspendeer celpellet door de vinger te vegen (~ 5 keer) en voeg 1 ml warm groei muis medium (zie tabel 1). Eventueel los toegankelijk celgroepen en gelyseerde cellen / DNA geprecipiteerd door voorzichtig pipetteren de celsuspensie op en neer (vijfmaal). Plate muis gemengde gliacellen op PDL-gecoat glas dekglaasjes of 60 mm gerechten zoals beschreven in stap 4.3.19 – 4.3.21. Was de cellen de volgende ochtend met warm groei muis medium en vervolgens om de andere dag. Muis gemengde glia is gebruiksklaar voor immunocytochemie 48-72 uur na uitplaten. Rat Microglia Isolation Cultuur rat gemengdglia in 75 cm2 weefselkweek flessen in groeimedium (zie tabel 1) gedurende 10 dagen. Schud microgliale cel clusters van gemengde gliale kweken op een roterende schudinrichting in een celkweek incubator (5% CO2, 37 ° C) bij 140 rpm gedurende 1 uur. Haal de microglia-bevattende supernatant van gemengde glia culturen, door te geven door middel van een 40-micron cel zeef en houd de cel suspensie in steriele 50 ml buizen. Opmerking: Microgliale culturen gewoonlijk> 95% zuiver na deze stap met weinig verontreinigende OPC en zeer weinig astrocyten. Eventueel vervangen groeimedium op gemengde glia culturen voor toekomstige microglia shake-offs. Typisch voer transactie in verschillende microglia shake-offs (eenmaal per week) van gemengde gliale culturen. Eventueel naar hogere zuiverheid 95% plaat krijgt 10 ml van de microglia-supernatant (stap 4.5.2) per 100 mm petrischalen en geïncubeerd in een celkweek incubator gedurende 30 minuten bij 37 ° C. alleen microglia zal hechten aan petrischaaltjes, terwijl de astrocyten en OPC's in de bovenstaande vloeistof blijven. Schud petrischaaltjes met de klok mee en tegen de klok in (vijf keer per stuk) in de celkweek kap. Aspireren celkweekmedium volledig en vervangen door 10 ml groeimedium. Resulteert microglia culturen> 98% zuiver. Cultuur microglia tot 7 dagen in DMEM aangevuld met 1% FBS en 1% penicilline / streptomycine. Rat OPC / oligodendrocyt Isolation Voor het verkrijgen van sterk verrijkt OPC culturen schudt microgliacellen eerst van 10 dagen oude gemengde gliale kweken gekweekt in 75 cm2 kolven op een roterende schudinrichting bij een celkweek incubator (5% CO2, 37 ° C) bij 140 rpm gedurende 1 uur. Gooi microglia alleen bevattende bovenstaande vloeistof of het gebruik voor microglia-specifieke experimenten (zie stap 5.5). Vervang de microglia-bevattende bovenstaande vloeistof met 10 ml groeimedium en afschudden gemengde gliale culturenander 18 uur op een roterende schudinrichting bij 200 opm (5% CO2, 37 ° C). Verzamel de microglia- en OPC-bevattende supernatant van gemengde glia culturen en passeren door een 40-micron cel zeef. Verzamel de celsuspensie in steriele 50 ml buizen. Eventueel vervangen groeimedium op gemengde glia culturen voor toekomstige OPC shake-offs. Opmerking: OPC's blijven woekeren op astrocytaire feeder lagen en kan worden geschud-korting op het tweede en derde keer (één keer per week), zij het met een lager rendement. Plaat 10 ml microglia- en OPC-supernatant in 100 mm Petrischalen en incubeer in celkweek incubator gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Microglia zal hechten aan de petrischaaltjes, terwijl OPC's en astrocyten in de bovenstaande vloeistof blijven. Schud petrischaaltjes met de klok mee en tegen de klok in (5 keer elk) in een celkweek kap. Neem slechts een paar petrischaaltjes in een tijd van celkweek incubator (microglia start loskomen van het Huisdierri gerechten als krachtig geschud in koelere gemiddeld). Verzamelen en combineren de OPC-bevattende supernatant in 50 ml buizen. Voeg desgewenst kweekmedium Petrischalen voor gebruik bij microglia-specifieke experimenten. Eventueel verdere verhoging van de zuiverheid van OPC culturen Herhaal stap 5.6.5 en 5.6.6 eenmaal met verse petrischalen belope van microglia in OPC preparaten verlagen. Spin down-verrijkt OPC bevattende supernatant in centrifuge gedurende 5 minuten bij 250 xg, 4 ºC. Zuig het supernatans zonder de celpellet. Reactie 3 ml van de bovenstaande vloeistof boven de pellet te resuspenderen en start OPC door vinger te vegen (10 keer). Voorzichtig fijnstampen OPC celgroepen door middel van een 10 ml pipet (5-10 maal). Aantal cellen en plaat 50.000 OPC per 25 mm dekglaasje (PDL-coating) in een plas 400 pl groeimedium in een 6-putjes en liet de cellen hechten gedurende 30 min in een celkweek incubator (5% CO2, 376, C). Zachtjes voeg 2 ml warm proliferatie medium (zie tabel 1) aan elk putje. PDL-gecoate 60 mm celcultuurschalen, plate 1-1.500.000 OPCs in 3 ml medium proliferatie. Zorgvuldig vervangen FBS-bevattend proliferatie medium met verse proliferatie medium 3 uur na plating de OPC (zorg ervoor dat OPC's goed bevestigd en niet los tijdens het medium verandering). Exchange medium elke tweede dag. Opmerking: Rat OPC culturen bereid met behulp van dit protocol zijn meestal 90% zuiver met microglia als de belangrijkste soort vervuilende cel, gevolgd door astrocyten. 5. Immunocytochemie behulp HIgM12 in het jeugdwerk Cellen Glial Triple-label Immunofluorescentie behulp HIgM12, anti-PSA mAb, en het type cel specifieke markers in het jeugdwerk Glial Cellen van WT en NCAM knock-out muizen Onder levende cellen omstandigheden, label 60% confluent muis gemengd glia culturen uit WT en NCAM KO muizen gekweekt op PDL-gecoate25 mm dekglaasjes met HIgM12 (10 ug / ml) en anti-PSA mAb (kloon 2-2B) (10 ug / ml) in PBS aangevuld met 10% FBS bij 4 ° C gedurende 30 min. Was de cellen drie keer gedurende 20 seconden elk met ijskoude PBS gesupplementeerd met 10% FBS en bevestig met 4% paraformaldehyde in PBS, pH 7,4 gedurende 15 minuten bij 25 ° C. Wassen gefixeerde cellen tweemaal gedurende 1 minuut elk met PBS gesupplementeerd met 10% FBS en doorlaatbaar cellen met 0,1% Triton-X100 in PBS, pH 7,4 gedurende 2 minuten bij 25 ° C. Was de cellen tweemaal gedurende 1 minuut en label met gliale merkers GFAP (astrocyten) of IBA-1 (microglia) (1 ug / ml) in PBS aangevuld met 10% FBS overnacht bij 4 ° C in de koelcel. Ga verder met standaard immunofluorescentie voorwaarden waaronder DAPI-bevattend montage medium 31. Let op: het gebruik van fluorescent gelabelde Fab 2-fragmenten als secundaire antilichamen voor menselijke (HIgM12) en muis (anti-PSA mAb, kloon 2 – 2B) IgM's wordt sterk aanbevolen. Neem fluorescerende afbeeldingen in 60X of 100X vergroting. Gebruik dezelfde instrument voor alle beelden en verwerken van afbeeldingen identiek. Immunofluorescentie Labeling van endo-NF-behandelde WT gliacellen met behulp HIgM12 als Primary Antibody Cultuur WT muis gemengd glia gekweekt 3 dagen in Neurobasal A aangevuld met 10% FBS en B27 supplement (1:50) op PDL-gecoate 25 mm dekglaasjes. Add ENDO-NF (30 ug / ml) aan 1 ml cultuurmedium en incubeer overnacht in een celkweek incubator (37 ° C, 5% CO2). Label cellen leven in de kou met HIgM12 en interne astrocytaire marker GFAP na fixatie en permeabilisatie zoals beschreven in de stappen 5.1.1 tot en met 5.1.5. Neem fluorescerende beelden op 60X of 100X vergroting. Gebruik dezelfde instrument voor alle beelden en verwerken identiek.