Создание установки с высокой пропускной способностью для скрининга малых молекул, которые модулируют с-ди-GMP Передача сигналов в<em> Синегнойной</em

Примечание: Процедуры клонирования и трансформации очищенного репортер плазмиды с-ди-GMP обсуждаются в другом месте 12. 1. Генерация GFP с меткой с-ди-GMP Reporter P. Штамм палочки Инокулируйте 5 мл лизогении бульона (LB) среду с одной колонии P. палочки и инкубировать в течение ночи при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту. Передача 2 мл ночной культуры в 200 мл свежей среды LB в 1-литровую колбу и инкубировать при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту. Монитор оптической плотности при длине волны 600 нм (OD 600) каждые 30 мин путем отбора пробы 1 мл из колбы и исследовать с помощью спектрофотометра (как было описано ранее 12). Когда OD 600 достигает от 0,3 – 0,5, место 40 мл культуры в 50 мл коническую центрифужную пробирку. Гранул клетки центрифугированием при 8000 оборотах в минуту в течение 10 мин при температуре 4 ° С, отбросить супернатант и ге-суспендирования клеток в 40 мл охлажденного на льду, стерильный, 300 мМ раствор сахарозы. В пробирке осадка клеток во второй раз с помощью центрифугирования, как описано на стадии 1.5, и вновь приостановить в 20 мл охлажденного на льду, стерильный, 300 мМ раствор сахарозы. В пробирке осадка клеток в последний раз центрифугированием, как описано на стадии 1.5, и вновь приостановить в 400 мкл охлажденного на льду, стерильный, 300 мМ раствор сахарозы. Примечание: Плотность клеток в этой точке должно быть приблизительно 1 х 10 11 колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ / мл). Охладить клетки на льду в течение 30 мин, после чего они готовы к электропорации. Добавить 1 мкл плазмиды 12 раствора 0,2 мкг / мкл pCdrA :: GFP C до 40 мкл P. палочка электрооптические компетентные клетки , полученный выше в микроцентрифужных трубки 1,5 мл , который был предварительно охлажденным на льду. Смешайте суспензии и переносят в предварительно охлажденные, 2 мм расстояние между электродами, кювету для электропорации. Примечание: pCdrA :: GFP </em> C: pUCP22Not-P CDRA -RBSII- GFP (Mut3) -T 0 -T 1, Amp г Gm г, что дает флуоресцентное считывание внутриклеточного уровня с-ди-GMP в P. штаммы палочка, была разработана и подтверждено Rybtke и др. 12. Удаления влаги с наружной стороны кювета с папиросной бумагой и поместить кювету в отборную камеру электропоратора. Импульсный с напряжением 2,5 кВ, емкости 25 мкФ и сопротивление 200 Ом. Удалите кювету и добавляют 1 мл LB среды. Затем перенесите клетки в стерильном 1,5 мл микроцентрифужных трубки и инкубировать в течение 2 ч при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту. Спред 10 мкл, 50 мкл и 100 мкл аликвоты культуры на стерильные LB-чашках с агаром, дополненной ампициллином (в концентрации 100 мкг / мл), и инкубировать пластин при 37 ° С в течение ночи. Подтвердите выражение GFP (excitatiна при 485 нм, эмиссия при 520 нм), исследуя пластину под флуоресцентным микроскопом со стандартным каналом GFP и выбрать одну колонию для инокуляции 5 мл LB. Выдержите в течение ночи, как описано в пункте 1.1. Смешать 0,5 мл ночной культуры с 0,5 мл 50% глицерина в 2 мл с завинчивающейся крышкой трубки и хранят при -80 ° С. 2. Подготовка закваски для инокуляции За два дня до экрана, плиты П. палочки штамм (содержащий pCdrA :: GFP С плазмидой) , от -80 ° C на складе с LB-агаром (с добавлением ампициллина в концентрации 100 мкг / мл), осторожно распространяя бактерии на пластину с помощью стерильной прививка петля. Инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 37 ° С. Вечером перед показом, прививают одну колонию P. палочки от пластины в 10 мл LB – среды (с добавлением ампициллина в концентрации 100 мкг / мл) в Tuбыть и инкубировать предварительной культуры в течение ночи при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту. В день экрана, подготовить субкультуру из ночной предварительной культуры путем разбавления его сначала со свежей средой LB к OD 600 1,0 , а затем дополнительно разбавляя 5% LB до OD 600 0,04 (1:25 соотношение) , Примечание: Общий объем инокулированной среды зависит от количества пластин, подлежащего испытанию. 5% LB производится путем разбавления 100% LB с фосфатным буферным солевым раствором (PBS) до требуемой концентрации. Важно отметить, что средства массовой информации (5% LB) позволяет конститутивную активацию pCdrA :: Gfp C в P. палочки. Добавьте стерильный стержнем магнитной мешалки в контейнер и перемешивать культуру при минимальной скорости на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, что позволяет бактерии акклиматизироваться в средствах массовой информации, прежде чем они разливают в 384-луночные планшеты. 3. Посев и инкубация из 384-луночные планшеты, содержащиеМалые молекулы Примечание: Стерильность и хорошие асептические методы имеют огромное значение для следующих шагов. Для получения положительного контроля (100% ингибирования), добавьте 20 мкл тобрамицина сульфата (25 мг / мл) до 10 мл (адекватная до 12 пластин) субкультуры, полученного на стадии 2.3 и аккуратно перемешать. Внесите 40 мкл положительной контрольной культуры в лунки А23 – P23 (Рисунок 2). Для получения отрицательного контроля (0% ингибирования), добавляют 30 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) до 10 мл (адекватная до 12 пластин) субкультуры, полученного на стадии 2.3 и аккуратно перемешать. Пипетка 40 мкл негативной контрольной культуры в лунки А24 – Р24 (рисунок 2). Для каждой из пластин штампованными с малыми молекулами, прививают объемом 40 мкл разбавленных ночных культур (описанных в пункте 2.3) в лунки А1 – Р22 (рисунок 2). Примечание: Это может быть достигнуто с помощью жидкостного обработчика разбойничатьВЗ. Из-за неоднородности свойств бактериальных культур, важно поддерживать постоянный и умеренное волнение, чтобы держать бактерии последовательно распределенные в средствах массовой информации во время отпуска. Для этого, продолжайте перемешивание акклиматизировались культуру со стадии 2.4 магнетически во время выдачи. Уплотнение пластин со уплотнение крышки воздухопроницаемого и инкубировать в течение 6 ч при 37 ° С. Примечание: воздухопроницаемой уплотнение имеет решающее значение для поддержания неизменных условий во всех 384 скважин и обойти потенциальное развитие кислородных градиентов через пластину. 4. Измерение роста (OD 600) и внутриклеточного с-ди-GMP уровня (GFP) Приблизительно за 30 минут до спектрофотометрических измерений, предварительно подогреть ридере до 37 ° С, чтобы избежать конденсации влаги. Осторожно удалите воздухопроницаемый уплотнение крышки перед чтением. Измеряют оптическую плотность при длине волны 600 нм с установкой 10 вспышек на лунку иосадительную время 0,2 сек. До начала измерения флуоресценции, сделать автоматический коэффициент усиления и регулировки фокусного на основе хорошо A24 (отрицательный контроль) и установите целевое значение коэффициента усиления на уровне 75% (рисунок 2). От управляющего программного обеспечения для считывания планшетов, нажмите на измерения начальной и нажать на '' Фокус и регулировки усиления / Пластинчатые идентификаторы 'Вкладка'. Выберите '' Регулировка фокуса '' и '' Channel A '' справа на окне. Выберите '' настройки усиления '' и '' Selected хорошо '' и введите '' 75 '' как '' Целевое значение ''. И, наконец, выбрать хорошо A24 в макете пластины, прежде чем нажать на '' Пуск Настройка ''. После того, как регулировка осуществляется, нажмите на '' Start измерения ''. Измерьте флуоресценции от GFP репортера на максимумами возбуждения / испускания 485/520 нм с установкой 10 вспышек на лунку и settliнг время 0,2 сек. Сбор данных из всех исследованных пластин. Примечание: чтения данных автоматически сохраняются по умолчанию в программном обеспечении пластины управления читателем. Просмотр показаний, нажав на иконку "Марс" в программном обеспечении управления, чтобы открыть пакет статистического анализа. Получить данные по "двойным щелчком" на пластине № интереса для доступа к данным для анализа. 5. Анализ данных Оценка однородности и воспроизводимости анализа с использованием анализа Robust Z ', которая является наиболее распространенной метрики качества представленные для экранов с высокой пропускной способностью. Вычислить надежную г ', используя формулу: Где MAD (медианное абсолютное отклонение) является оценкой стандартного отклонения, р положительный контроль (100% ингибирования) и п отрицательный контроль (0% ингибирования) для обоих OD 600 и GFP Values. Примечание: анализ с прочном значение Z (рассчитано как для OD 600 и GFP необработанных данных) больше или равно 0,5, считается отличным анализом. Подсчитайте% -ное ингибирование роста по формуле: Где Xi OD600 является итерированным значение OD 600 каждого образца хорошо. % Ингибирования OD600> 0, ингибитор роста; % Ингибирования OD600 <0, стимулятора роста. Оценка% ингибирование внутриклеточного уровня с-ди-ГМФ с использованием формулы (изменение в единицах интенсивности флуоресценции произвольной корректируются для изменения плотности клеток): Где Xi GFP является итерированным значение GFP каждого образца хорошо. % Ингибирования GFP> 0, ингибитор с-ди-GMP; % &# 160; ингибирование GFP <0, с-ди-GMP промотор. Установить порог для обнаружения попадания в 3 Обезумевший от медианы (медиана ± 3 MAD), рассчитано из образца хорошо для чтения минусами каждой пластины, предполагая нормальное распределение данных точек. Примечание: Тем не менее, ± 50% ингибирование отсечка могут быть выбраны для более точных и воспроизводимых анализов ответа на дозы при необходимости.