تسجيل درجة الحرارة التي يسببها العصبية آخر من خلال مراقبة التغيرات الكالسيوم في البصلة الشمية من<em> القيطم المورق</em
Summary
Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.
Abstract
The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the γ-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the γ-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.
Introduction
Over the last years, temperature sensitivity has no longer been described as a somesthetic sense only, but also as a physiological function relevant for the olfactory system. In rodents, the main olfactory bulb receives input from the Grueneberg ganglion (GG), an organ in the nasal cavity, consisting of thermosensitive neurons. GG neurons respond to cool temperatures1 as well as to chemical stimuli, and their chemosensitivity is modulated by temperature fluctuations2. These observations suggest that the olfactory bulb may integrate chemical and temperature information collected at the nose. In order to explore this hypothesis, we present here a set of experiments enabling the detection of temperature responses in the olfactory bulb of non-transgenic animals, using the Xenopus laevis larva as a model. The organization of the olfactory system in these animals closely resembles that of mammals. The olfactory receptor neurons of premetamorphic X. laevis terminate in tufts, and make synaptic contacts with the dendrites of second-order neurons, the mitral cells. Pre- and postsynaptic fibers intermingle and form skein-like neuropil structures called glomeruli3. The abundant synapses of the glomerular layer represent the first processing center of olfactory information. Mitral cells further integrate the sensory input and convey it to higher olfactory areas.
We have developed a protocol combining electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) with calcium-sensitive and non-sensitive dyes followed by bolus loading of the postsynaptic network of glomeruli and mitral cells. The staining by electroporation of two spectrally distinct dyes loaded in the nasal cavities serves to single out the γ-glomerulus3 through its bilateral innervation by ORNs from both olfactory epithelia. Thus, the location of the γ-glomerulus is identified prior to further measurements. Subsequently, bolus loading4 with Fluo-8 acetoxymethyl (Fluo-8 AM) is carried out in a volume comprising the γ-glomerulus. Imaging calcium changes with fast confocal microscopy allows the visualization of temperature responses in the 3D neuropil surrounding the γ-glomerulus, a unique temperature-sensitive glomerulus in this system5. Mitral cells innervating this specific structure can also be identified by their Ca2+ signals responsive to induced temperature drops. Next, activity correlation imaging6 uses the specific Ca2+ traces of these cells to reveal the dendritic morphology of thermosensitive mitral cells. Alternating repeated applications of cold Ringer solution and chemical odorants in one measurement can be used to visualize the mitral cell networks for odor and temperature processing surrounding the γ-glomerulus and identify potential overlaps. To unambiguously assign the responses to either the chemical or the temperature stimulus, we constantly monitor temperature at the olfactory epithelium.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأساليب المقدمة هنا تهدف إلى معالجة درجة حرارة تسجيل في البصلة الشمية من القيطم المورق الضفادع الصغيرة. البقع البروتوكول الأول والخلايا العصبية من الدرجة الثانية في البصلة الشمية ويوفر إعداد عينة التي لا يزال النظام الشمي سليمة أساسا. وهكذا، فإن تفعيل γ-الكبيبة حساسة للحرارة يمكن رصدها ومقارنة مع الكبيبات جيرانها الحساسة للعلاج الكيميائي. هو تصور تعصيب الثنائي الفريد لهذه الكبيبة من Electroporation للخلية مع الأصباغ المختلفة طيفيا. وعلاوة على ذلك، البلعة تحميل يسمح لتلطيخ الخلايا التاجية التي تغطي حجم كبير داخل البصلة الشمية. وكشف عن الإشارات التي يسببها درجة حرارة تجهيز شبكة الخلايا العصبية عن طريق أخذ القياسات الكالسيوم مع تطبيقات التحفيز المتكرر وبعد ذلك تحليل البيانات مع التصوير النشاط الارتباط.
بروتوكول يسلط الضوء على اثنين متطورة تلطيخ صناعة تج اإلجراءات، وكلاهما يتطلب التلاعب وممارسة الحذر من أجل تحقيق نتائج مرضية وقابلة للتكرار. خلال Electroporation لللابد من تجنب أي ضرر من الحيوانات، خصوصا عند وضع الأقطاب في فتحتي الأنف. على النحو الأمثل، ينبغي أن يحدث أي اتصال مع الظهارة الشمية. لاحظ أن الحيوانات لا تزال تعيش بعد إجراء Electroporation للويجب أن تؤخذ وقت الانتعاش في الاعتبار. إذا بقي تلطيخ ضعيفة للغاية بعد جولة واحدة من Electroporation لل، الذي يمكن أن يحدث تبعا لأنواع من الأصباغ المستخدمة، شدته يمكن أن تتعزز من خلال زيادة تركيز الصبغة في الخياشيم. منذ يتم نقل جزيئات جانب ديكستران عبر عدة آليات بما في ذلك النقل محور عصبي بطيء (بسرعة من 1-2 ملم / يوم 10) والانتشار السلبي، بديل آخر هو الانتظار لمدة 48 ساعة بعد Electroporation للأمام التضحية الحيوانات. بدلا من ذلك، قد يتم تكرار Electroporation للبعد يوم واحد من الانتعاش.
jove_content "> بولس التحميل هو خطوة حاسمة منذ كمية من الصبغة دخول الخلايا التاجية من الصعب تنظيم ويعتمد على معايير مختلفة مثل حجم ماصة ومكان التطبيق. مراقبة اجراءات تحت المجهر مضان متحد البؤر يبرهن على أن تكون مفيدة ل تعديل مدة تطبيق الصبغة، وبالتالي تحقيق نتائج تلطيخ مماثلة في أنحاء الاستعدادات. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تستخدم الضفادع الصغيرة electroporated سابقا لتحديد أفضل موقف لتطبيق الصبغة عن طريق تحديد موقف الكتلة الصغيرة (التي تضم γ-الكبيبة). والأكثر خطوة حاسمة خلال القياسات هي لتجنب كلا التحول وتبيض من العينة. هذا التحول يمكن تجنبها عن طريق وضع بعناية تدفق قارع الأجراس تحت المجهر. أما بالنسبة للحد من تبييض مجال الاهتمام، ينبغي خفض وقت القياس إلى ما هو جوهري .البلعة تلطيخ تحميل مع الأصباغ الكالسيوم الحساسة يوفر سوى جدامحدود النقيض منذ الخلايا السليمة عموما مستويات الكالسيوم منخفضة، وبالتالي تظهر ضعف مضان القاعدية. تطبيق التصوير النشاط ارتباط تلتف هذا الحد عن طريق توليد المقابل تقوم على الهياكل النشاط ويسلط الضوء على إشارات الكالسيوم مماثلة. هذا أسلوب التحليل بعد الحيازة يحسب عامل ارتباط بين إشارة الكالسيوم من منطقة مختارة من الفائدة (تتبع مرجعية) وذلك لكل بكسل الفردية في حجم 3D. ولذلك، فإن النتائج التي تم الحصول عليها بقوة تعتمد على نمط النشاط المحدد كما أثر المرجعية. إذا كان التركيز الرئيسي هو تصور أنماط الخلية تعصيب التاجية، ويفضل إشارة مرجعية مستمدة من نشاط الخلايا العصبية عفوية، واختيار الخلايا التاجية الأكثر نشاطا سوف تنتج أفضل النتائج. للكشف عن شبكات chemo- أو الحرارية الحساسة الخلايا التاجية، وآثار إشارة لا يحتوي إلا على الردود على أي الحامض الاميني أو قارع الأجراس البارد يجب أن يكون محددا. اختيار من الكبيبة س بأكملهص سوما الخلية التاجي والمنطقة من الفائدة قد لا توفر دائما تتبع مرجعية واضحة، خاصة إذا كانت الهياكل الاستجابة لاثنين من المحفزات المختلفة يكذبون على رأس كل منهما الآخر. في مثل هذه الحالة، غالبا ما يكون مفيدا لتحديد منطقة أصغر من الكبيبة أو خلايا الجسم والمنطقة من الفائدة.
في العقود الأخيرة، وقد وصفت Electroporation للكطريقة فعالة لصبغ الخلايا وحيدة أو متعددة 11،12. هنا يتم استخدامه لتسمية تحديدا الخلايا العصبية مستقبلات الشم. جزيئات ديكستران مترافق تعطي أعلى كفاءة، والأصباغ الحساسة غير الكالسيوم، ومجموعة من اختيار واسع وتغطي الطيف الكامل تستخدم عادة في مضان المجهر 13. ومع ذلك، والأصباغ الكالسيوم الحساسة التي electroporated بنجاح في الخلايا العصبية مستقبلات حاسة الشم هي في الوقت الراهن يقتصر على ديكستران الكالسيوم الأخضر، وفلوو-4 ديكستران إذا كانت لا تزال متاحة تجاريا. الى جانب ذلك، التسجيلات تستهدف في المقام الأول superficiaطبقات لتر على السطح البطني من البصلة الشمية فقط، لأن عمق تغلغل تقنيات قياس سرعة محدودة. التصوير ثنائي الفوتون يمكن التغلب جزئيا هذا الحد ولكن غالبا ما تفتقر إلى السرعة ويحد من كمية الأصباغ الكالسيوم الحساسة اختيار أكثر من ذلك.
وصفنا هنا بروتوكولا لقياس النشاط الناجم عن درجة الحرارة في البصلة الشمية. يتم فحص neuropil الدماغ كوحدة تخزين ثلاثي الأبعاد لتصور الشبكات الخلوية المعقدة التي تنطوي عليها معالجة حاسة الشم من درجة الحرارة. قياس النشاط الناجم عن درجة الحرارة في البصلة الشمية تم الإبلاغ مؤخرا جدا 5 ويتطلب إجراء تفصيلها خصيصا الجمع بين التقنيات المختلفة. ومكسبا كبيرا من التقنيات المعروضة أعلاه هو أن يتم تصوير مئات من الخلايا في ثلاثة أبعاد في إعداد الاكبر من حيث نظام حاسة الشم لا يزال سليما. هذه المزايا على مطالب عالية على تقنيات التلوين فضلا ع المخالتعويض والتصوير. على سبيل المثال، Electroporation للخلية والبلعة تحميل ضرب كميات كبيرة من الخلايا في الظهارة الشمية ومصباح، وبالتالي تمكين التصور الشبكات الخلوية كاملة. وعلاوة على ذلك، وتسليم المؤشرات الكيميائية عن طريق تحميل بلعة بدلا من fluorophores المرمزة وراثيا تمكن القياسات في مجموعة يحتمل أن تكون أكبر من الأنواع. بدائل أخرى مثل حضانة حمام مع AM الأصباغ تعمل في المقام الأول في شرائح التي تضر البصلة الشمية بشدة، ولم يتبق سوى بضع مئات من ميكرومتر من أنسجة سليمة. في المقارنة، وإعداد جبل كامل المستخدمة في بروتوكول لدينا يضمن على سبيل المثال أن تعصيب الثنائي من γ-الكبيبة لا يزال سليما، وبالتالي فهي تؤخذ التسجيلات في نظام لا يزال المنطوق. وأخيرا، ويتم التصوير في حد ذاته سطرا إضاءة المجهر السماح باقتناء كميات 3D. خط إضاءة المجهر هي واحدة من تقنيات مبائر توفير أعلى معدلات الاستحواذ المحتملة 6 </ سوب> والتي هي ضرورية لتغطية جزء كبير من البصلة الشمية. ويمكن استخدام نظم جمع أبطأ ولكن لديها عيب أن حجم الحجم المسجل يجب تخفيض. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت أساليب أخرى لالتقاط صور سريع ويمكن استخدامها كبدائل 14،15. ومع ذلك، لا يزال خط إضاءة المجهر واحدة من أسهل الطرق لكسب كل من السرعة والدقة الكافية. وفي ما يلي بعض المعلومات عن المبادئ التوجيهية لاختيار الاجهزة التصوير المناسبة. منذ يتم التصوير الكالسيوم داخل من الاستعدادات الدماغ سميكة، يجب الإعداد توفر confocality لائق ويجب أن يكون لأهداف فتحة العدسة من 1.0 أو أعلى. لنقطة مرجعية، والتسجيلات التي اتخذت مع خط إضاءة المجهر تتوافق مع الصور التي التقطت مع معيار مجهر المسح الضوئي ليزر مع حجم الثقب من 0.5-1 وحدة متجدد الهواء. سريع سرعة اكتساب أمر مرغوب فيه. وحدة تخزين مع سمك 20 ميكرون مشمولة لا يقل عن 5 لترايرز، حقل الجانبي نظر 100 ميكرون × 100 ميكرون وحجم بكسل 0.5 ميكرون أو أصغر يجب أن تفحص بسرعة لا تقل عن 1 هرتز في كومة. يمكن الحد من confocality زيادة كمية الفوتونات تحصى، وبالتالي يسمح لعمليات استحواذ أسرع إذا لزم الأمر، ولكن لديه عيب وتسجيل المزيد من الضوء خارج نطاق التركيز. ومع ذلك، نظرا لأن هذا النهج يزيد من سمك الشرائح الضوئية، يمكن أن تسهل فعلا تعقب التشعبات من خلال مختلف ض الطائرات بعد تطبيق ACI 6.
الأدوات اللازمة للدراسة على نطاق واسع تجهيز درجة الحرارة في شبكات البصلة الشمية يتم عرض هذه الوثيقة. يتم تسجيل النشاط الناجم عن درجة الحرارة في الأولى والثانية الخلايا العصبية النظام عن طريق الأصباغ وإشارات على حد سواء القادمين والمغادرين من γ-الكبيبة الكالسيوم الحساسة. وعلاوة على ذلك، إلى أي مدى تجهيز خلايا تاجي الفردية يمكن تقييم كل من المعلومات الكيميائية ودرجة الحرارة. منذ ليا إعدادفيس البصلة الشمية سليمة، ودور تعصيب الثنائي في تجهيز حاسة الشم يمكن لمزيد من الدراسة. الإجراء مفيد أيضا للكشف عن مدى وكيفية حراري وchemoinformation يتم ترميز في تداخل شبكات حاسة الشم 5. وأخيرا، فإن التقنيات المذكورة أعلاه لا تقتصر على دراسة الردود درجة الحرارة في البصلة الشمية ولكن يمكن تطبيقها لتقييم أعم من نظام حاسة الشم، وخاصة شبكات المعالجة الخلوية في ثلاثة مجلدات كبيرة الأبعاد. البلعة التحميل والتصوير النشاط الارتباط هي أدوات قوية لمراقبة ومقارنة النشاط العشرات من الخلايا العصبية، مما يجعلها قابلة للتطبيق على شبكات الدماغ المختلفة (16).
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the DFG Excellence Cluster 171, the Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, the Bernstein Center for Computational Neuroscience and the ENC-Network, an Erasmus Mundus Joint Doctoral Program. The authors thank Stephan Junek, Mihai Alevra and Guobin Bao for providing MATLAB codes and custom-written programs for image evaluation and data analysis.
Materials
| Reagents | |||
| Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
| Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
| D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
| Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
| Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
| Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
| MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
| DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
| NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
| Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
| Funnel applicator | (Custom-made) | ||
| Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
| Objective W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
| Objective W Plan-Apochromat 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |
Referenzen
- Mamasuew, K., Breer, H., Fleischer, J. Grueneberg ganglion neurons respond to cool ambient temperatures. Eur J Neurosci. 28 (9), 1775-1785 (2008).
- Brechbühl, J., Moine, F., Broillet, M. -. C. Mouse Grueneberg ganglion neurons share molecular and functional features with C. elegans amphid neurons. Front. Behav. Neurosci. 7 (193), (2013).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. J Comp Neurol. 489 (4), 403-424 (2005).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. J Neurosci. 35 (20), 7892-7902 (2015).
- Junek, S., Chen, T. W., Alevra, M., Schild, D. Activity correlation imaging: visualizing function and structure of neuronal populations. Biophys J. 96 (9), 3801-3809 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis. , (1994).
- Schild, D. A computer-controlled device for the application of odors to aquatic animals. J Electrophysiol Tec. 12 (2), 71-79 (1985).
- Bao, G., Schild, D. Fast and Accurate Fitting and Filtering of Noisy Exponentials in Legendre Space. PLoSONE. 9 (3), (2014).
- Terasaki, M., Schmidek, A., Galbraith, J. A., Gallant, P. E., Reese, T. S. Transport of cytoskeletal elements in the squid giant axon. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (25), 11500-11503 (1995).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. Chemical Calcium Indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Salome, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy using acousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154 (1), 161-174 (2006).
- Keller, P. J., Ahrens, M. B., Freeman, J. Light-sheet imaging for systems neuroscience. Nature Methods. 12 (1), 27-29 (2015).
- Hjorth, J. J., et al. Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks. Dev Neurobiol. , (2015).
