通过的嗅球钙监控录像的变化温度引起的神经元电活动<em>非洲爪蟾</em

与非洲爪蟾蝌蚪所有实验均根据道德哥廷根大学委员会在动物实验核准的准则进行。 1.电穿孔根据新科普和法贝尔7选择阶段49-54的动物。 确保记录装置由一个大的工作距离并能够在至少2 Hz的频率施加20伏的电压脉冲20毫秒电穿孔装置的立体的。通过两个铂电极用200μm的粗径施加电压脉冲，以便它们可以被插入到蝌蚪'鼻孔，而不会造成损坏。 制备葡聚糖共轭染料的晶体（ 例如，钙绿10 kDa的葡聚糖，或的Alexa Fluor 647 10 kDa的葡聚糖）由5毫克的通常输送量溶解于约100μl的蒸馏水，并让小液滴2微升的封口膜的板材干燥。 注：晶体不到一天的时间晾干，可在-18℃，之后在冰箱中储存期限超过一年的。 通过将它们在含有三卡因甲磺酸3％1-2分钟，直到它到达其特征在于手术麻醉状态自来水麻醉动物心脏速率，所有运动的损失和缺乏对机械刺激的反应减少。 沉浸在麻醉的动物在纯净的自来水10秒。 广场上的凝胶垫的动物，并通过将其周围的针而不伤害它解决它。 注意：不要通过其皮肤戳针固定的动物。 轻轻擦干​​周围用纸巾鼻孔的区域。 将动物的体视显微镜下，专注于鼻孔。 使用镊子挑大小相匹配的鼻孔孔的染料晶体，将其放置在鼻腔中的一个，等到它完全溶解，WHICH需要不到1分钟。如果晶体较小，加入2或3到每个空腔，直到它们产生一个非透光高浓缩溶液。 放置在阴极上的蝌蚪的皮肤和阳极插入鼻孔中的一个。 注：此特定设置适用于1.3步提到的染料。用于与不同极性的染料，染色结果可通过将阴极插入鼻孔得到改善。如果不能确定染料的极性，两个电极可以同时在鼻孔（每鼻孔一个）放置，并单电压脉冲之间交替的极性。 应用的20 V和20毫秒的六个脉冲大约0.5秒刺激间隔的。 注意：小气泡应该提供的电极与皮肤和鼻孔的溶液接触的电穿孔中出现在鼻孔电极周围。如果没有气泡可见检查连接电缆，确保电穿孔德维奇e的传送所需的电压脉冲。 重复第二鼻孔的过程（1.9-1.11）。 转移电穿孔蝌蚪成在室温下充满自来水的烧杯中。等待5到10分钟，直到动物苏醒并恢复游泳。给它并让它恢复为至少1天，在此期间染料沿着嗅神经至嗅球输送。 在使用1-7天电穿孔动物电的最佳成像效果如下。给至少24小时的时间前成像染料运输和恢复。 2.整装准备麻醉动物在含有三卡因甲磺酸3％，直到所有的动作都停止，它不再响应机械刺激自来水。 转移蝌蚪到凝胶垫在立体显微镜下，并通过经由皮肤上的FO的每一侧戳针紧紧固定它rebrain。 通过切断其脊髓牺牲蝌蚪。 使用手术刀解剖出含有鼻腔，嗅觉神经和嗅球（ 图1A）的组织块。使第一个切口靠近左边的鼻孔，不接触和移动刀片切割着旁边的左嗅神经和灯泡，直到端脑，间脑的边框。这样做右侧。通过使最后的切割后的端脑隔离来自神经系统的其他部分的制备方法。 蝌蚪体内的处置，并仔细翻转组织块上下颠倒使大脑制备的腹侧面向上。 通过插入嗅觉神经之间的两针针再次组织块。 放的青蛙Ringer溶液（98毫摩尔NaCl，2mM的氯化钾的下降，1毫氯化钙 ，2mM的MgCl 2的，5mM葡萄糖，5mM的丙酮酸钠，10毫米的HEPES，调节至pH 7.8，osmola对组织230 mOsmol / L）的RITY。 通过用细剪刀三切口取出覆盖在轴突分拣区脑膜和嗅球。从组织块的后缘开始，沿左嗅球caudorostrally紧密切直到入口点的嗅觉神经进入灯泡（轴突分拣区）。 重复步骤2.8右半球。 提高与钳脑膜和使所述第三切口，垂直于以往在轴突分拣区域。 注意：嗅球的腹侧是现在用于成像和丸药加载访问。 为了提高透射光图像的图像质量，重复背侧的过程。这些额外的步骤可以方便的微量为丸药装载的导航，但不是绝对必要的。 将样品转移到充满青蛙林格氏用于进一步处理和成像的记录室中。让小号URE该腹侧朝上，并与尼龙纤维的网固定样品跨越在小的铂帧。 对于刺激的一个更简单的应用放置在鼻腔的尼龙纤维中的一个的顶部。 3.丸装载在含有的Pluronic F-127的20％的二甲亚砜20微升（DMSO）中溶解钙AM染料（ 例如，的Fluo-8 AM）的50微克（重量/体积），以制备调幅染料的储备溶液。在1-2微升体积小等分冻结股票的解决方案。该原液为至少半年稳定的，但避免反复冻融。 使用微量拉马拉移液器5-8MΩ的电阻和1-2微米的尖端直径。 溶解在青蛙Ringer溶液的染料制备的储备溶液在250-500微米的浓度。 添加MK571达到500μM的浓度以阻止多药耐药转运。 使用一个细长枪头填充10微升该溶液的微量和轻弹微量除去所有气泡。 安装在吸液管保持器的微并确保压力可以用注射器或充气药物喷射装置是手动施加并监视用压力计所施加的压力。 如果可能，使用一个显微镜的设置有能力来激励注入染料，使得从微量移液器尖端流出可以可视化和调整。理想情况下，使用共焦成像设置。使用正置显微镜用浸泡的目的，这样的组织可以与微管抵达。 放置在显微镜下，整个安装制备，遵循嗅神经直到灯泡和聚焦到在嗅球感兴趣的区域。 灌注通过记录室新鲜林格氏溶液，以增加制剂的可行性和洗出的染料泄漏从微量移液器尖端。 降低吸移管到嗅球的表面上，与尖端指向成制剂的延髓方向。 应用一个小而恒定正压力（〜25百帕）到微量，以防止移液管的堵塞，并轻轻将其插入组织中。 一旦吸管违反外组织层，将它在rostro手背方向到僧帽细胞层。 （请注意，通过电穿孔嗅觉受体神经元的一个计数器染色有助于调节微量的立场。）理想的是，放置在移液管尖端在50-100微米从期望的记录部位的距离。 染色温度敏感性γ-肾小球，从γ-肾小球的突触前神经纤维的位置定位的区域约50μm吻侧。 在100-200百帕的范围内施加正压。视的大小调整压力强度微量移液器尖端。通过留意下当施加首次压力明亮光照明可见轻微组织运动确认从吸管的流出。 保持约10分钟的恒定压力，而微量残留在组织中。如果可能的话，请在此期间对小区负载的神经纤维在荧光灯的照明，如加载成功会导致可见单元胞体染色随着时间的推移不断增加强度。 注：通常不成功装载的原因是吸管堵塞是由于进入尖端或聚集染料集群组织。有时可以通过对录音室的下表面轻轻打破其尖端营救吸管。然而，枪头不应超过几微米。通过快速装载过程中施加压力较低的补偿更大的吸管开口。 装载的10分钟后，所施加的压力减小到零，并检查染色。 注意：染色区域的大小显著变化，并取决于几个参数，如注射染料和喷射站点的位置的量。一个良好的染色占地面积约100微米×100微米的区域。 如果污渍区域过小或没有覆盖所需的录制现场，重复步骤3.10-3.13。如果它尚未堵塞使用相同的微量为下一次注射。 在开始任何实验，让染率和脱酯化之前等待最后一次注射后至少30分钟。继续在任何时候都新鲜林格液灌注到录音室。 4.测量设置确保该测量设置由具有足够的速度共焦显微镜来记录三维卷。选择每堆至少1 Hz的采集速率。 注：适用设置包括例如线照明显微镜扫描样品行明智的，而不是由对点oint。一个简单的实现这种设置的先前已描述6。其它选项旋转盘显微镜。如果没有这样的设置是可用的，它仍然是可能的与正常点扫描设置来测量较小的区域。 设置测量参数，使得足够大，以适应肾小球大小的体积可以被覆盖。 注意：记录卷的典型厚度是在其中应至少5层所覆盖的20微米的范围内。 检查所有漂白突触前测量。调整激光功率，直到所记录的图像的平均荧光强度不随记录的时间过程下降。 限制对突触后侧的记录，以避免漂白尽可能测量时间和面积，虽然测量超过20-30秒漂白是可能发生。 5.气味应用和温度实验将25毫升新鲜林格氏溶液（预先保存在4℃），在50毫升的管中。把试管冰桶。 通过插入温度计的清洁探头插入管监视冷却林格氏的温度。等到温度低于1℃，开始实验前。 以10μM的浓度制备50毫升溶解在林格氏溶液L-组氨酸。 使该室中的水流量保持的刺激溶液的释放期间是恒定的和不间断的使用漏斗涂布器8或允许刺激递送伴随的灌注林格氏类似的应用的系统。漏斗以这样的方式定位，该远端出口是从嗅觉上皮小于1mm距离。 放置连接到数字温度计接近上皮和漏斗涂布器的出口的镍铬 – 镍温度传感器。接线温度计输出端口到一个计算机来记录和视觉DIS玩反映温度波动小的电压变化。 在实验开始前，另一个热传感器连接到一个标准温度计以建立电压 – 温度比例因子。 调查在该记录室中的浴温度，并确保其不超过22℃。 启动图像采集，并通过一个电子移液管顺序地应用200-400微升冷林格氏，L-组氨酸和室温林格氏（20-22℃）的20-30秒的刺激间隔。为了更好地控制刺激应用，释放的刺激与由所选择的成像设置发送到吸管如果可能的触发信号。重复再现的结果应用协议。 就拿套较长的录音与几轮的刺激，因为他们是最好的与活动相关成像成像后分析。 注：拍摄时间和切片生存能力之间的折中被发现。的约 2分钟覆盖6刺激应用测量提供对网络的良好重建足够的活性。 6.图像处理使用活动相关成像（ACI） 突触前录制的图像处理与由冷林格溶液和组氨酸刺激的录音，可以通过不同的反应条件（参见Kludt 等人 5）区分从相邻组氨酸敏感肾小球温度敏感性γ-神经纤维。 创建在从脑制剂，其中ORNs已电穿孔用两种不同的染料以可视化的γ-肾小球的双边神经支配的录音轴向方向上的最大强度投影。 在突触后录音中使用活动相关成像的图像处理（ACI） 有足够的时间点（超过10个选择的录音0帧）和活动，像样的数目（至少两个事件）。 注意：活动可以是自发通过刺激多个应用程序在相同的记录过程中，揭示单个僧帽细胞的过程或引起以显示由嗅觉刺激激活了蜂窝网络。 选择的录音，其中所测量的结构在记录的时间过程移至不超过2-3个像素。 注：运动过多录音可通过应用Kludt 等人的转变校正程序被救出5。 检查是否录音从漂白苦。如果整个图像的平均强度下降在记录的时间过程，漂白校正是必要的，否则跳过下两个步骤。 通过进行线性回归计算每个像素的时间跟踪的线性趋势。 从每个像素减去的结果分别以消除线性的直流电阻漂白的吨。 注意：可以通过宝和席尔德9描述中使用的替代配件勒。 有一步一步的指导的活动相关成像（ACI）由Junek 等 人一起下载现成利用MATLAB脚本。6 注：按照Junek 等 6作为替代描述使用提供的MATLAB脚本的步骤。 从下载容器用于数据评价系统的MATLAB的路径移动文件'aci.m'，'matVis.m'和'aci_roiSelector.m'。 装载作为组织为[X，Y，Z，T] -矩阵与x和y所指的横向尺寸，Z，轴向方向和t的时间过程，以MATLAB的用户的工作区的可变在步骤5.8中获取的原始数据。 从MATLAB命令行调用“阿哲”。 在用户界面（UI）其中出现时，选择“准备数据”，然后选择包含的数据，并在其中将结果保存在目录中的变量。 注：对于UI的完整说明请参阅手册伴随阿哲脚本。 通过测量Z-层由UI移动对应的滑块可以得到显示的变化映射的概述滚动。 输入感兴趣区域（ROI）到用户界面的区域的大小。要僧帽细胞胞体调节的ROI以跨越在轴向方向在横向大约10微米和5微米。对于肾小球，为20μm横向和10μm轴向略微较高的值是适当的。 注意：ROI大小必须输入作为像素数，这取决于选择用于记录的像素缩放。 用鼠标中键点击到CENTE选择包含周围僧帽细胞的每个可见SOMA的γ-肾小球和附加区域的投资回报率细胞/肾小球河关闭触发相关的计算映射所有参考曲线的主界面。结果自动保存并显示出来。