Çizgili Deneyi Disosiye Hipokampal Nöronlar kullanarak Protein Substrat çekici veya itici Aktivite Eğitim için
Summary
Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2’s ability to repel cultured hippocampal neurons.
Abstract
Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.
Introduction
Akson rehberlik yeni oluşan nöronlar sinir sistemi 1,2 geliştirilmesi sırasında hedef aksonları göndermek süreçtir. Gelişmekte olan aksonlar büyüme konisinin denilen kendi ucunda son derece hareketli yapısını taşıyacak. büyüme konisinin aksonun yolunu gezinmek için hücre dışı ipuçları algılar. Rehberlik gibi yarık, semaforin'in olarak moleküller, ve ephrins, çekmek ya da akson 1,3,4 üzerinde uygun reseptörleri ve ko-reseptörleri ile etkileşim bağlı olarak aksonlar dağılmasına neden olabilir. aktive reseptörler akson ve büyüme konisi hareketler için onun iskelet organizasyonunu etkileyen büyüme konisinin sinyalleri aktarmak.
Çeşitli yöntemler, çekici madde ve itici moleküllerin etkisini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Kemo-çekiciler ve kovucular bir degrade konsantrasyonuna sahip büyüme / kültür ortamı içine uygulanabilir (örn., Dunn odası veya μ-slaytlar) mikro-p yüksek konsantrasyonlu noktada 5,6,ipette (örn., torna deneyi) 7 ya da banyo uygulaması (örn., büyüme konisi çöküşü deneyi) 8,9 ile homojen bir konsantrasyonda.
Diğer yöntemler, bir kemo-çekici ya da kovucu bir alt-tabaka 10-12 kadar bir plaka yüzeyi üzerinde kaplandığı bir şerit deneyi ya microcontact baskı (μCP) içerir. Thestripe tahlil başlangıçta civciv retino-tectal sisteminde 13 topografik haritalama analiz etmek 1987 yılında Bonhoeffer ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. Orijinal yöntem çizgili ve örgülü matrisleri kullanarak polikarbon Nucleopore membranlar üzerine kaplama proteinlerine bir vakum sistemi gereklidir. Sonraki sürümlerinde, rekombinant proteinleri doğrudan dar yarık silikon matrisler 14,15 kullanarak çizgili desen bir kültür plaka yüzeyinde basıldı. Son zamanlarda, çeşitli araştırma grupları başarıyla akson rehberlik molekül faaliyetleri 16-21 analizine bu şerit tahlil uyguladık.
<p class = "jove_content"> Burada ayrışmış hipokampal nöronlar için akson rehberlik moleküllerinin çekim ya da itme ölçen bir şerit testi için ayrıntılı protokol mevcut. Özellikle, bu yöntem, minimal donatılmış laboratuvar ortamlarında uygulanabilir. Bu tahlil için, flüoresan bir alt-tabaka ve bir kontrol proteini sırayla değişen şeritler 90 mikron aralıkları olan bir silikon matris kullanarak plastik tabak üzerinde oluşturulan ve laminin ile kaplanmış. Bizim gösteri, E15.5 farelerin hipokampal nöronlar fibronektin ve lösin zengin transmembran protein-2 (FLRT2) ve Fc proteini 21 kontrol rekombinant ekto şeritler alternatif kültüre edildi ayrışmış. Kültür 24 saat sonra, akson ve nöronların hücre gövdeleri hem güçlü FLRT2 çizgili itilir edildi. Bir anti-Tau1 antikorla boyama FLRT2 itici güçlü olduğunu göstermektedir, nöronların% 90 FLRT2-Fc ile ~% 10 ile karşılaştırıldığında, Fc kaplı bölgelere nm yayıldığını gösterdihipokampal nöronlar 21 işlevi.Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol E15.5 fare hipokampus rekombinant protein ve ayrışmış nöronlar kullanan bir şerit deneyi anlatır. Bu deney, bir çizgili kalıp yerleştirilir ilgi konusu bir rekombinant proteinin nöronların, itici, çekici, ya da nötr yanıtların etkin gözlem sağlar. Bu protokolün bir büyük avantajı, özel matrisleri, bir vakum sistemi gerektirir, geleneksel yönteme kıyasla bir protein ile doğrudan plastik bir kaba yüzeyi üzerine yazdırılma şeritler, üretilmesi için basit bir yöntem ve bir Nucle…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 and 26670090 to S.Y.).
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Violamo | 1-3500-01 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai | 01954-85 | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody | Thermo Scientific | A11013 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody | Thermo Scientific | A-21203 | Dilution 1/500 |
| Anti-Tau1 antibody | Chemicon | MAB3420 | Dilution 1/200 |
| Antifade | Thermo Scientific | P7481 | Alternative mounting media may be used |
| B27 supplement | Thermo Scientific | 17504-044 | Dilution 1/50 |
| Bovine serum albumin | Sigma | 01-2030-2 | |
| Cell strainer 100 um | BD Falcon | 352360 | |
| Centrifugation machine | Kubota | 2410 | |
| Cover glass 18mmx18mm | Matsunami | 18×18 mm No. 1 | |
| DAKO pen | DAKO | S2002 | Alternative water-repellent pen may be used |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#11 | |
| FBS | Thermo Scientific | 10437-028 | |
| Fluorecent microscope | Nikon | E600 | |
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050-061 | Dilution 1/200 |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 805N | 22 gauge, 50 uL |
| HBSS | Thermo Scientific | 14170-112 | |
| Human IgG, Fc Fragment | Jackson | 009-000-008 | |
| Laminin | Thermo Scientific | 23017-015 | |
| Neurobasal | Thermo Scientific | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| PBS | Nacalai | 14249-24 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | Dilution 1/100 |
| Plastic culture dish, 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| Silicone Matrices | Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu) | ||
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Tip, 1000 uL | Watson | 125-1000S | |
| Transparent sticky tape | Tesa | 57315 | Alternative sticky tape may be used |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Trypan blue, 0.4% | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Scientific | 25300-054 | |
| Culture medium | Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin. |
Referenzen
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941 (2010).
- Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
- Ming, G. -. l., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -. j., Poo, M. -. m. Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
- Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
- Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
- Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
- Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
- Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
- von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
- Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
- Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
- Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
- Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
- Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, 6084-6093 (2012).
- Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
- Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
- Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).
