La medición de la producción de dióxido de carbono a partir de sustratos radiomarcados en<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.
Abstract
El poder de la genética de Drosophila cada vez más se está aplicando a las preguntas de la señalización de la hormona y el metabolismo y para el desarrollo de modelos de enfermedades humanas en este organismo. Se necesitan métodos sensibles para mediciones de los parámetros tales como las tasas metabólicas para conducir la comprensión de la fisiología y la enfermedad en los animales pequeños, tales como la mosca de la fruta. El método descrito aquí se evalúa la oxidación de combustible en un pequeño número de moscas adultas alimentadas alimentos que contienen cantidades traza de 14 sustratos de C marcado tales como glucosa o ácidos grasos. Después de que el período de alimentación y cualquier manipulaciones experimentales adicionales, las moscas se transfieren a tubos cortos cubiertos con malla, que luego se colocan en viales de vidrio que contienen papel de filtro saturado con KOH que las trampas exhalados, radiomarcado CO 2 genera a partir de la oxidación de sustratos radiomarcados como bicarbonato de potasio, KHCO3. Esta bicarbonato radiomarcado se mide por recuento de centelleo. Esto es aqenfoque CUANTITATIVA, reproducible y sencilla para el estudio de oxidación del combustible. La utilización de la glucosa marcada radiactivamente, ácidos grasos o aminoácidos permite la determinación de la contribución de estas diferentes fuentes de combustible para el metabolismo energético en diferentes condiciones, como la alimentación y el ayuno y en diferentes fondos genéticos. Esto complementa otros enfoques utilizados para medir en el metabolismo energético vivo y debe favorecer la comprensión de la regulación metabólica.
Introduction
El trabajo en el organismo modelo Drosophila melanogaster ha contribuido en gran medida a la comprensión de los principios genéticos, los procesos de desarrollo, el crecimiento, el envejecimiento, el comportamiento, la inmunidad y la enfermedad humana 1,2. Un sinnúmero de planteamientos biológicos genéticos y celulares en Drosophila ha impulsado el progreso en estas áreas. Sin embargo, el estudio del metabolismo en la mosca de la fruta ha desarrollado más lentamente, debido en gran parte a las dificultades en la medición de parámetros metabólicos en un animal tan pequeño. El interés en el uso de Drosophila como modelo para el estudio de enfermedades humanas tales como la diabetes y para la comprensión de la contribución del metabolismo y crecimiento a diversas patologías ha empujado el campo para desarrollar y adaptar las técnicas metabólicas para este organismo 3,4.
Los métodos fiables están ahora disponibles para la medición de una serie de parámetros metabólicos en la mosca de la fruta. Por ejemplo, es sencillo para evaluar la ingesta de alimentos <shasta> 5, los niveles de triglicéridos almacenados y glucógeno, así como los niveles circulantes de la hemolinfa de la glucosa y el principal azúcar que circula en la mosca, trehalosa, que es un disacárido compuesto por dos moléculas de glucosa 4. El uso de trazadores metabólicos ha permitido el estudio de la absorción de nutrientes de la dieta y la conversión de los nutrientes absorbidos tales como glucosa al glucógeno formas de almacenamiento y los triglicéridos 6. Las tasas metabólicas pueden ser evaluadas a la mosca de la fruta a través de la medición del consumo de oxígeno y dióxido de carbono 7,8 (CO 2) de producción. El ciclo del ácido cítrico oxida unidades de dos carbonos que pueden entrar en el ciclo, como acetil coenzima A (CoA), que se deriva a partir del metabolismo de carbohidratos de la dieta y almacenados y ácidos grasos. Cada vuelta del ciclo genera una molécula de cada uno de GTP (o ATP) y el donador de electrones FADH 2, tres moléculas de NADH, y dos moléculas del producto de desecho CO 2. Producción de CO 2 puedeser utilizado para estimar la tasa metabólica basal. La producción total de CO 2 se puede cuantificar en Drosophila mediante el uso de respirómetros disponibles comercialmente o hechas a mano 9-10,11.
La medición del total de la producción de CO 2, especialmente cuando se combina con la medición del consumo de O2, proporciona información valiosa sobre el metabolismo de la energía en todo el cuerpo. Sin embargo, esta medida no se identifica el nutriente que se oxida para la producción de trifosfato de adenosina (ATP). Tres clases principales de nutrientes pueden entrar en el ciclo del ácido cítrico después de la conversión a acetil CoA: hidratos de carbono, ácidos grasos y proteínas. La glucosa-6-fosfato, derivado de la glucosa en la dieta o glucógeno almacenado, se puede convertir en piruvato que se descarboxila por piruvato deshidrogenasa para formar acetil CoA. Degradación de los ácidos grasos derivados de la dieta o de los triglicéridos almacenados por los rendimientos de oxidación ß-acetil CoA que entra entonces en el ciclo del ácido cítrico. Finalmente, Una mayoría de los aminoácidos puede entrar en el ciclo del ácido cítrico después de la conversión a piruvato, acetil CoA reductasa o ácido cítrico intermediarios del ciclo tales como alfa-cetoglutarato.
contribución-nutriente específico para el metabolismo energético durante basal y condiciones estimuladas se puede controlar mediante el uso de trazadores radiactivos. El protocolo que aquí se presenta está adaptado para su uso en Drosophila de un protocolo utilizado para evaluar la oxidación en las células cultivadas en cultivo de 12,13. En este enfoque, moscas de la fruta son alimentados con 14 sustratos C-radiomarcado metabólicos (hidratos de carbono, ácidos grasos o aminoácidos) en la dieta durante un corto (horas) o largos (días) de pulso, perseguido en alimentos sin etiqueta, y luego expuestos a una cámara que contiene hidróxido de potasio saturada con papel de filtro (KOH) para la captura de CO exhalado 2 como bicarbonato. bicarbonato radiomarcado se puede cuantificar mediante recuento de centelleo. Las diferencias en radiomarcado-producción de CO 2 entre el experimentoAL grupos de moscas pueden reflejar el uso de diferentes combustibles para la producción de ATP en el transcurso de una prolongada diferencias rápidos o intrínsecas en el metabolismo de combustible entre los genotipos, por ejemplo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método para la medición de la oxidación de sustratos radiomarcados específicos en adultos Drosophila melanogaster. Esta técnica es sencilla, cuantitativo, reproducible y sensible, y complementa los métodos existentes que miden la producción total de CO 2 y el consumo de O 2, ya que puede ser utilizado para identificar el nutriente (s) que se oxida para la producción de ATP.
Medición de CO 2 liberado de la oxidación de sustratos radiomarcados específicos utilizando el método descrito aquí es complementaria a las técnicas que miden la producción total de CO 2. Total de producción de CO 2 (V CO2) permite la estimación de la tasa metabólica y, cuando se conoce total del consumo de O 2 (V O2), la tasa metabólica puede ser calculada y la fuente de combustible para la oxidación puede ser calculada de acuerdo a la relación de intercambio respiratorio (V CO2 / O2 = V RER). Cuandohidratos de carbono son el sustrato exclusivo, RER = 1, pero cuando los ácidos grasos son la fuente exclusiva, RER = 0,7, debido a la estequiometría de las reacciones de la glucosa y la oxidación de los lípidos. A falta de equipo para medir el consumo de oxígeno en Drosophila 14, no se puede identificar la fuente de combustible oxidativo. Sin embargo, por medio del etiquetado vuela con trazas de un sustrato radiactivo u otro y las tasas de medición de radiomarcado producción de CO 2, se pueden sacar conclusiones acerca de la capacidad de las moscas para oxidar un sustrato dado en diferentes momentos a lo largo de un estímulo o sobre los efectos de una dado mutación en la oxidación de combustible.
Hay una serie de pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, se debe tener cuidado cuando se utilizan materiales radiactivos para evitar derrames y contaminación de las áreas de investigación. En segundo lugar, cuando anestesiar las moscas durante los pasos 2.1 y 3.4, el experimentador debe trabajar con rapidez para evitar los efectos de CO 2 prolongadala exposición sobre el metabolismo y el comportamiento. Un grupo de 20 moscas puede ser anestesiado y se transfiere a un nuevo vial o en una vaina de mosca en 20 seg o menos. Cuando se transfieren desde un aparato de anestesia a un vial de alimentos, el vial debe descansar en su lado para evitar que las moscas anestesiadas de conseguir pegado en la superficie del alimento. Cuando las moscas son alimentos radiomarcado alimentado a lo largo de varios días como en el paso 2.2, el experimentador debe asegurar que la comida no se seque como las moscas son sensibles a la deshidratación.
El estado alimentado o en ayunas antes del marcaje, la elección de la etiqueta, la longitud de tiempo etiquetado, la longitud de tiempo en la vaina de la mosca, y el método de la anestesia son parámetros que pueden ser sometidos a la solución de problemas y la modificación utilizando esta técnica. En primer lugar, las moscas se somete a períodos cortos de etiquetado (2 – 3 h) no es probable que consumen cantidades importantes de alimentos radiomarcado a menos sometido a un periodo de ayuno de antemano. En segundo lugar, la elección del marcador cun afectar las conclusiones uno es capaz de dibujar sobre fenotipos metabólicos. Por ejemplo, radiomarcado producción de CO 2 a partir de D- [1- 14 C] -glucosa puede reflejar la oxidación a través del ciclo del ácido cítrico o la derivación de las pentosas fosfato, mientras radiomarcado producción de CO 2 de D- [6- 14 C] -glucosa refleja la oxidación a través del ciclo del ácido cítrico única 12,15,16. La alimentación de las moscas con un trazador radiomarcado para un aminoácido esencial 17,18 sería una buena estrategia para la evaluación de la oxidación de los aminoácidos derivados de proteínas. Finalmente, largos períodos de etiquetado con la glucosa radiomarcada también plantean la posibilidad de incorporación de este precursor en otras clases de moléculas, tales como los triglicéridos 19 y aminoácidos tales como alanina, que fácilmente interconvierte con piruvato. Esto se puede evaluar mediante la medición de radiactividad incorporada en estas diferentes clases de moléculas de 6. rad De hecho, las cohortes separadas de moscas pueden ser alimentadosiolabeled sustratos de la misma manera y luego se usa para los experimentos de la mosca de la vaina o la medición de radiomarcador que se almacena y se mantiene en glucógeno y triglicéridos en alimentación y de ayuno 6, por ejemplo. Otra estrategia es utilizar períodos de etiquetado corto que pueden revelar la oxidación de los nutrientes de la dieta radiomarcados sí mismos y no formas de almacenamiento de estos nutrientes. En tercer lugar, también es posible que dos grupos de moscas podrían tener tasas idénticas de 14 CO 2 producción de más de una determinada cantidad de tiempo, pero muy diferentes tasas inicialmente. Por lo tanto, la variación de la cantidad de tiempo que vuela pasar en la vaina de la mosca puede ser un parámetro importante para alterar la hora de evaluar la variación fenotípica. Por último, este protocolo exige el uso de un corto período de CO 2 anestesia cuando se ponen las moscas en el aparato mosca vaina. Es posible que los CO 2 anestesia pueden afectar la función metabólica en el transcurso del experimento mosca vaina. Una alternativa unaENFOQUE es utilizar anestesia nitrógeno que no afecta a la tasa metabólica 20.
Como con cualquier técnica que mide un sistema tan complejo como la oxidación de combustible y la tasa metabólica, el método descrito aquí tiene limitaciones. En primer lugar, es posible que vuela en diferentes grupos podrían consumir diferentes cantidades de comida radiomarcado y por lo tanto se introduzca la fase de recogida de CO 2 del ensayo con diferentes cantidades de partida de sustrato. Esto puede ser controlado para, en cierta medida llevando a cabo el experimento con muestras de gran tamaño y por la alimentación de las moscas en masa. Para períodos cortos de etiquetado, moscas con agallas de color azul similares se han consumido el marcador radiactivo y se puede llevar adelante a la porción de la persecución del experimento. La cantidad de radiomarcador que queda en un grupo de moscas también puede medirse al final del experimento y en cohortes independientes de moscas después del final de la alimentación y período de caza inicial. En segundo lugar, los niveles de actividad entregrupos de moscas en las vainas de moscas pueden ser diferentes. Esto tendrá que ser determinado experimentalmente y tenido en cuenta en la interpretación de los datos. En tercer lugar, esta técnica no mide la producción total de CO 2, sólo la producción de un alimento dietético específico o la forma (s) de almacenamiento de ese nutriente. Este protocolo no es un sustituto para, sino que es complementaria a las mediciones de VCO 2, ya que proporciona información diferente y adicional.
El método descrito aquí exhalado mide, CO radiomarcado 2 que es un producto de la oxidación de cantidades traza de sustratos metabólicos específicos. Mediante la variación de la etiqueta utilizada – glucosa, ácido graso, o ácido amino – uno puede diseñar experimentos cada vez más sofisticadas para evaluar las contribuciones de los diferentes sustratos a metabolismo en diferentes condiciones fisiológicas, tales como el hambre y en diferentes fondos genéticos. Las futuras aplicaciones de esta técnica incluyen la medición de metabolism en las etapas de larva y pupa de desarrollo, dos etapas del ciclo de vida de Drosophila que se caracterizan por condiciones extremas de almacenamiento de nutrientes y la descomposición, respectivamente.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks Drs. Mingjian Lu and Morris Birnbaum for helpful advice and funding support from NIDDK (R21DK089391).
Materials
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12X75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | 09-874-20 | ||
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
Referenzen
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetik. 199 (3), 639-653 (2015).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut. Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).
- Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).
- Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila. Genetik. 165 (2), 623-635 (2003).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry. JoVE. (88), e51681 (2014).
- Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress. Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).
- Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides. Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).
- Ontko, J. A., Jackson, D. Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations. J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).
- Vincent, A., Briggs, L., et al. parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress. Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).
- Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices. J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).
- Katz, J., Wood, H. G. The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism. J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).
- Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).
- Sang, J. H., King, R. C. Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults. J Exp Biol. , (1961).
- Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis. J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the “rate of living” model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).
