Injeção de células Singênico Murino melanoma para determinar o seu potencial metastático nos pulmões
Summary
Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.
Abstract
Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating “experimental” metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.
Introduction
A metástase é uma das principais causas de morte entre os pacientes com doenças malignas. O processo de disseminação metastática de células cancerosas é mal compreendida, mas parece envolver vários passos, incluindo a invasão de tecidos adjacentes, intravasamento no sistema linfático e na vasculatura, a sobrevivência e a translocação dentro do sistema circulatório, o extravasamento a partir da vasculatura no local de metástases, adaptação para o novo microambiente do novo local, e colonização no novo local por proliferação e formação de tumores secundários 1. Cada um destes eventos biológicos envolvem a transformação, a difusão e a sobrevivência de células tumorais metastáticas. Por exemplo, a transformação do fenótipo epitelial da célula tumoral para um fenótipo mesenquimal, juntamente com a interacção bem sucedida com a matriz extracelular, permitir-lhes invadir tecidos adjacentes e metastizar para outras partes do corpo. 2,3 Além disso, estes metastático célulasdeve sobreviver dentro da corrente sanguínea circulante e escapar à vigilância imunitária do hospedeiro. 4,5 Finalmente, quando implantados num local distante dentro do corpo, as células tumorais têm de se adaptar ao seu microambiente, a fim de proliferar e formar tumores secundários. 6,7 Portanto , embora a metástase é um fenômeno comum entre pacientes com câncer, as células tumorais metastáticas ter várias áreas de vulnerabilidade que são passíveis de intervenção terapêutica.
Dada a natureza imunogênica de melanoma, eo recente interesse em imunoterapias, os modelos de melanoma são cada vez mais útil. 8 Nos Estados Unidos sozinho, o melanoma é a causa de um número estimado de 9.000 mortes por ano. 9 locais mais comuns de metástase de melanoma são ossos, cérebro , fígado e pulmões. A maioria das metástases para locais distantes ocorrer através da corrente sanguínea. Circulating células tumorais no sangue deve escapar depuração imunológica, chegar a um leito capilar de um órgão distai einvadem através das células endoteliais do vaso sanguíneo, de modo a estabelecer-se com sucesso. 4-7,10, 11
Para imitar os fenómenos comuns e virulentas de metástase, a linha celular B16-BL6 murino foi criado. Um falecido da linha parental C57BL / 6 de células de melanoma B16-F0, B16-BL6 é o produto final de 10 sucessivas selecções para a metástase do pulmão a partir da injecção intravenosa (resultando em B16-F10), seguido por 6 selecções sucessivas para a penetração da membrana da bexiga. 12 Como tal, é uma linha celular de melanoma de confiança para a criação de focos metastáticos no rato, particularmente quando injectado por via intravenosa. 13
Após a injecção de uma quantidade suficiente de B16-BL6 células na veia da cauda de um rato B57BL 6 /, seguido por duas ou mais semanas para permitir a implantação e o crescimento das células B16 / BL6, focos metastáticos formará nos pulmões. Após a eutanásia e inspeção por microscopia dissecando, o número deindivíduo focos presente pode ser quantificada. Este, por sua vez, pode ser utilizado para estabelecer um efeito de dose-metástase, como o número de células B16-BL6 injectadas correlaciona-se com o número de focos formados na superfície dos pulmões. Este modelo é conhecido como "metástase experimental", onde as células conhecidas-metastático são introduzidos directamente na corrente sanguínea, o que facilita uma disseminação e estabelecimento rápida e previsível nos pulmões, no fígado, ou outro órgão de investigação. Isto está em contraste com a "metástase espontânea", onde as células tumorais são implantados, muitas vezes por via subcutânea, e metástases originam organicamente produzir células tumorais 14,15.
É importante para injectar uma quantidade apropriada de células B16 / BL6 nas veias da cauda dos ratinhos. Muitos, e os pulmões será coberto com metástases e focos vizinhos, serão indistinguíveis uns dos outros. Muito poucos, e a influência de um agente terapêutico será imperceptível devido à vari inerenteções entre as injecções. A fim de obter um número óptimo de focos nos pulmões dos ratinhos C57BL / 6, que é necessário para correlacionar o número de células injectadas com a quantidade de focos metastáticos estabelecida na superfície dos pulmões, tendo em conta o distinguishability do indivíduo focos. Este protocolo irá demonstrar um modelo de melanoma metastático de murino para murganhos C57BL / 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Circulating células tumorais a partir de uma injecção na veia da cauda representam as metástases que escapam locais de crescimento primário e migrar através de vias como a corrente sanguínea ou no sistema linfático, ocasionalmente, estabelecendo-se nos leitos capilares de locais distantes. 14 O protocolo descrito acima serve como um modelo para secundário metástases. Com um número óptimo de células B16-BL6 injectadas, experimentadores pode determinar o efeito relativo de um fármaco administrado ou população de células imune, pós-neutralização, sobre a metástase de células de cancro.
Este protocolo tem limitações. As células tumorais em circulação foram seleccionados pela sua capacidade para metastizar e são, por conseguinte, não imunogénico, tendo baixos níveis de histocompatibilidade principal de classe 1 do complexo moléculas. 12 Além disso, a introdução súbita e agrupado de grande número de metástases é ao contrário do cenário típico em pacientes em que um pequeno número de células tumorais metastáticasdissipam ao longo de um período de tempo prolongado a partir do local do tumor primário. Além disso, as células tumorais são introduzidos por via intravenosa, a partir de cultura de tecidos e não de uma origem do tumor primário. Por isso, estas células são ao contrário das metástases secundárias, que resultam de alterações na adesão celular, a migração, o reconhecimento imunológico e estabelecimento órgão destinatário 15,16.
Um protocolo alternativo seria a injecção subcutânea de células B16 / BL6 para a geração de tumores primários e a análise dos resultantes metástases pulmonares "espontâneas". Essas metástases "espontâneos" foram encontrados para conter mais heterogeneidade do que suas contrapartes "experimentais", combinando mais de perto aqueles de pacientes humanos. O protocolo está a limitar na sua capacidade para determinar a influência de um composto experimental em metástase. Com uma injecção na veia lateral da cauda, o número de células de melanoma injectado na corrente sanguínea pode ser aproximada através hemocytometer. Com metástase "espontânea", no entanto, existe uma maior heterogeneidade entre tumores, adicionando uma variável adicional para o número de focos resultante pulmão. 16
Em conclusão, o modelo de melanoma murino B16-BL6 veia da cauda representa um modelo simples para determinar a influência de um tratamento de imunoterapia ou de metástase. Por via intravenosa injecção de células tumorais em circulação, os investigadores podem replicar, em certa medida, os pacientes pós-metástase. Considerando os efeitos destrutivos de células tumorais metastáticas a os doentes com cancro, este modelo é uma ferramenta poderosa para a compreensão do processo de passos múltiplos de metástases.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoiado em parte por uma concessão do National Cancer Institute 1R03CA172923.
Materials
| Trypsin | Corning | MT25052CV | |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT15040CM | |
| Phase Contraast Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | |
| Micro-Fine IV Insulin Syringes | BD | 14-829-1D | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Mouse Restrainer | Braintree Scientific | NC9999969 | Restrainer choice depends on age/size of mice |
| Heating Pad | Harry Schein | NC0012697 | Optional |
Referenzen
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis. Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).
- Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease. Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).
- Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression. J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).
- Kang, Y., Massague, J. Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis. Cell. 118, 277-279 (2004).
- Hodi, S. F., et al. Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma. NEJM. 363 (13), 711-723 (2002).
- Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States. J. Am. Acad. Dermatol. 65, 133-143 (2011).
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).
- Weinberg, R. A. Is metastasis predetermined. Mol. Oncol. 1 (3), 263-264 (2007).
- Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials. Cancer Res. 56 (4), 875-879 (1996).
- Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406, 532-535 (2000).
- Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M. Tumor cell metastasis. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 5 (2), 87-114 (1986).
- Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Curr Protoc in Cell Biol. , (2001).
- Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review). Int. J. Oncol. 18 (4), 669-681 (2001).
- Hart, I. The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma. Am J Pathol. 97 (3), 587-600 (1979).
- Overwijk, W. W., Restifo, N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma. Curr Protoc Immunol. 20 (1), (2001).
