동계 쥐 흑색 종 세포의 주입은 폐에서 그들의 전이성 잠재력을 확인하는 방법

윤리 정책 : 연구 마우스의 사용은 기본적인 생물학 또는 질병의 최종 처리에 대한 인간의 이해를 발전 있습니다 경우에만 허용됩니다. 1. 주문 구매 여성 C57BL / 6 마​​우스 (6 세 – 8 주), 그룹 당 5 마우스. 쥐에 대한 몇 가지 일 조정할 수 있습니다. B16-BL6 셀의 제조 2 멸균 후드에서 37도 인큐베이터과 장소에서 세포 배양 플레이트를 제거합니다. 플레이트는 B16-BL6 생쥐 흑색 종 세포와 약 70 %의 합류해야합니다. 더 큰 합류는 세포를 전이 가능성을 변경할 수 있습니다. 1 분 동안 앉아 보자, 접시 당 1 ml의 0.05 %의 트립신 – EDTA를 추가 한 다음 트립신 미디어 솔루션을 대기음. 접시 당 트립신 1 ML을 추가하고 10 분 동안 인큐베이터에 번호판을 반환합니다. 멸균 후드로 인큐베이터에서 접시를 이동 한 후, 무 혈청 Rosewell 공원 기념 연구소 Mediu 4를 가하여각각의 판에 m (RPMI). 멸균, 전동 피펫 세포를 수집합니다. 세포를 파괴하는, 아주 약간의 각도를 누르면 끝으로, 플레이트의 바닥에 전지를 꺼냅니다. 그렇지 토출 바늘 막힘 수도 세포 덩어리의 적절한 분리를 보장하기 위해 여러 번 반복. 회상과 50 ML 원뿔 튜브에 전송할 수 있습니다. 셀 밀도를 결정하는 혈구를 사용합니다. 상수 B16-BL6 셀의 총 개수를 유지하는 무 혈청 RPMI의 양을 결정하는 것은 0, 0.065, 0.015, 0.25 및 0,500,000 세포 / ㎖의 최종 농도에 도달 할 필요가 있었다. 마찬가지로 15 ML 원뿔 튜브에 50 ML 튜브에 미디어 나누어지는. 5 분 동안 2,250 XG의 원추형 원심 분리 튜브. 미디어를 가만히 따르다. 무 혈청 RPMI의 적절한 볼륨을 추가하고 hemacytometer를 통해 원하는 세포 밀도를 확인합니다. 추가 RPMI을 추가하거나 회전하고 그에 따라 작은 볼륨 -에 재현 탁하여 densities- 조정합니다. 나누어지는 500 μL얼음에 표시된 1.8 ml의 튜브에 각각의 세포 현탁액. 3. 꼬리 정맥 주입 꼬리에 의해 개최 마우스를 가지고, 마우스 제한 수단으로 후방 먼저 안내합니다. 그것은 외부의 꼬리와 제한 수단의 주요 챔버의 몸통으로, 제한 수단의 끝으로 마우스를 잡아 당깁니다. 마우스가 고정 될 때까지 밀어 계속의 제한 수단 플런저를 삽입합니다. 측면 꼬리 정맥 중 하나가 위쪽으로 향하도록 90도 등 마우스를 회전합니다. 알코올 패드를 사용하여 적극적으로 꼬리 정맥을 가장 잘 보이는 곳에 특히 마우스의 꼬리 쪽 청소. 참고 : 좋은 조명이 B57BL / 6J 마우스에 효과적인 꼬리 정맥을 시각화 필수적이다. 가열 램프 나 가열 수술 패드는 불필요하지만, 또한 꼬리 정맥의 체적을 증가시킴으로써 도울 것이다. 멸균 배양 후드에서 2 백만 세포 / ㎖ 튜브에서 세포 배양 배지 300 μl를 수집한다. 의 S를 쓸어 넘겨, 바늘 전환IDE와 주사기에서 거품을 배출, 플런저를 밀어. 250 μL의 최종 부피가 발생하는 문화 RPMI를 꺼냅니다. 비 지배적 인 손으로 마우스 꼬리를 확장합니다. 비 – 지배적 인 손의 집게 손가락으로 상승 꼬리의 기단부와 엄지 손가락으로 눌려 꼬리의 말단부와 꼬리를 잡고. 주 : 이러한 방식으로, 꼬리 정맥을 횡 방향 위치에 유지하고, 꼬리의 더 선단 부분에서 가능하면 일치하는 엔트리와 상기 제한 수단의 표면에 평행. 우선 분 하향 각 말단부를 향해 꼬리 정맥에 주사 바늘을 삽입하고 (바늘을 주사기의 상대 플런저 단부 저하) 상기 삽입시의 꼬리 정맥의 각도와 일치하도록 바늘을 조정 . 꼬리 정맥에 바늘을 약 1cm를 삽입합니다. 삽입 후, 바늘이 정상 들고 플런저를 푸시하기 시작한다. 주 : 바늘 꼬리 정맥에있는 경우 및 바늘 끝이 N이고오티는 미디어가 정맥에 방해받지 않고 흘러해야 방해. 효과적인 주사를 정맥에서 혈액 통관을 특징으로한다. 이 저항 또는 기포 주입의 부위에서 형성되기 시작하면, 바늘을 제거하고, 꼬리 정맥을 따라 더욱 인접 위치에서 다시 시도. 정맥에서 바늘을 제거하고 폐기합니다. 어떤 출혈을 멈추게하는 항목 사이트에 거즈를 잡습니다. 제한 수단에서 플런저를 제거하고받는 사람 케이지에 마우스를 놓습니다. 다른 모든 농도에 대해 반복합니다. 참고 :. 폐 초점 설립은 약 2 소요 – 변화 셀 라인과 초점의 원하는 크기에 따라 함께 3 주 (9)를 중간에서 마우스 과도한 헥헥처럼, 초기 안락사를 보증 할 수 증상을 모니터링해야한다. 4. 폐 초점을 계산 CO 2를 공동 2 챔버에 배치하고 100 % 노출하여 마우스를 안락사 </sUB는> 5 분 동안 분 당 챔버 체적이 10 ~ 30 %로 도입했다. 자궁 전위에 따릅니다. 스티로폼에 마우스를 스플레이. 수술 가위를 사용하여 흉골을 따라 수술 절개를 만들 수 있습니다. 흉골 절개의 상단에서와 흉곽을 노출, 마우스의 어깨쪽으로 분기 모두 두 개의 추가 절개를합니다. 폐와 심장을 노출, 몸통에서 갈비뼈를 제거하기 위해, 두 컷, 흉골의 측면을 따라 각합니다. 수술 핀셋으로 마음을 잡고, 마우스에서 심장과 폐를 확보, 식도와 기관지를 잘라. 더 나은 시각화를 위해, 10 배 배율에서, 해부 현미경 아래에 배치합니다. 단지 두 개의 폐를 떠나, 폐에서 심장을 해부 및 흉선을 제거합니다. 해부 범위 아래에있는 폐와 폐의 초점을 계산하기 시작합니다. 각각의 초점은 폐의 표면에 원형, 갈색 강요로 나타납니다. 에 대한생쥐 간 일관성은 로브 (lobe)의 표면에 병소의 수를 카운트하고, 그 로브 반전. 네 개의 로브의 각 이렇게하면 개별적으로 쉽게 계산이 가능합니다. 유골을 폐기, 그렇지 않으면, 저장하고 IHC를 수행하는 경우 폐를 수정합니다.