Iniezione di cellule singenici del topo melanoma per determinare il loro potenziale metastatico nei polmoni
Summary
Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.
Abstract
Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating “experimental” metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.
Introduction
Metastasi è una delle principali cause di morte tra i pazienti con neoplasie. Il processo di diffusione metastatica delle cellule tumorali è poco conosciuta, ma sembra coinvolgere diversi passaggi, tra cui invasione dei tessuti adiacenti, intravasation nei vasi linfatici e vasi, la sopravvivenza e la traslocazione all'interno del sistema circolatorio, stravaso dal sistema vascolare presso il sito di metastasi, l'adattamento al nuovo microambiente del nuovo sito, e la colonizzazione al nuovo sito proliferazione e formazione di tumori secondari. 1 Ciascuno di questi eventi biologici coinvolgono la trasformazione, la diffusione e la sopravvivenza delle cellule tumorali metastatiche. Per esempio, la trasformazione del fenotipo epiteliale della cellula tumorale in un fenotipo mesenchimale, accoppiato con l'interazione positiva con la matrice extracellulare, consentire loro di invadere i tessuti adiacenti e metastasi in altre parti del corpo. 2,3 Inoltre, questi metastatico celluledeve sopravvivere all'interno del flusso sanguigno circolante e evadere la sorveglianza immunitaria dall'host. 4,5 Infine, quando impiantato in un sito lontano all'interno del corpo, le cellule tumorali devono adattarsi al loro microambiente per proliferare e formare tumori secondari. 6,7 Pertanto , anche se le metastasi è un fenomeno comune tra i pazienti affetti da cancro, le cellule tumorali metastatiche hanno molteplici aree di vulnerabilità che sono suscettibili di intervento terapeutico.
Data la natura immunogenica del melanoma, e il recente interesse per le immunoterapie, modelli per il melanoma sono sempre più utile. 8 Nei soli Stati Uniti, il melanoma è la causa di una stima di 9.000 morti l'anno. 9 sedi comuni di metastasi del melanoma sono ossa, cervello , fegato e polmoni. La maggior parte delle metastasi a siti distanti avviene attraverso il flusso sanguigno. Circolanti cellule tumorali nel sangue deve eludere spazio immunitario, raggiungere un letto capillare di un organo distale einvadono attraverso le cellule endoteliali dei vasi sanguigni per stabilire correttamente se stessi. 4-7,10, 11
Per simulare i fenomeni comuni e virulenti di metastasi, è stato creato la linea cellulare B16-BL6 murino. Un defunto della parentali C57BL / 6 linea di cellule di melanoma B16-F0, B16-BL6 è il prodotto finale di 10 selezioni successive per metastasi polmonari da iniezione endovenosa (con conseguente B16-F10), seguita da 6 selezioni successive per la penetrazione della membrana della vescica. 12 come tale, è una linea cellulare di melanoma affidabile per la creazione di foci metastatici nel topo, in particolare quando iniettato per via endovenosa. 13
Dopo l'iniezione di una quantità sufficiente di B16-BL6 cellule nella vena della coda di un B57BL / 6 del mouse, seguito da due o più settimane per permettere impianto e la crescita delle cellule B16 / BL6, foci metastatici formerà nei polmoni. Al momento l'eutanasia e l'ispezione al microscopio dissezione, il numero difoci presente individuo può essere quantificato. Questo, a sua volta, può essere utilizzato per stabilire un effetto dose-metastasi, come il numero di cellule B16-BL6 iniettati è correlato al numero di foci formata sulla superficie dei polmoni. Questo modello è conosciuto come "metastasi sperimentale", in cui le cellule conosciute metastatico vengono introdotti direttamente nel flusso sanguigno, favorendo una diffusione rapida e prevedibile e stabilimento nel polmoni, fegato, o di altro organo di indagine. Questo è in contrasto con "metastasi spontanee", in cui le cellule tumorali vengono impiantati, spesso per via sottocutanea, e metastasi provengono da organicamente capannone cellule tumorali. 14,15
E 'importante per iniettare una quantità appropriata di cellule B16 / BL6 nelle vene coda dei topi. Troppi, ei polmoni saranno coperti con metastasi e la vicina focolai saranno indistinguibili gli uni dagli altri. Troppo pochi, e l'influenza di un agente terapeutico sarà indistinguibile causa intrinseca varizioni tra le iniezioni. Per ottenere un numero ottimale di foci sui polmoni dei C57BL 6 topi /, è necessario correlare il numero di cellule iniettate con la quantità di foci metastatici stabilito sulla superficie dei polmoni tenendo conto la distinguibilità dei singoli foci. Questo protocollo dimostrerà un modello murino di melanoma metastatico in topi C57BL / 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Circolanti cellule tumorali da una iniezione coda vena rappresentare le metastasi che eludono i siti di crescita primaria e migrare attraverso percorsi come il sangue o il sistema linfatico, di tanto in tanto si stabilisce nei letti capillari di luoghi distanti. 14 Il protocollo sopra descritto serve da modello per la secondaria metastasi. Con un numero ottimale di cellule B16-BL6 iniettato, sperimentatori in grado di determinare l'effetto relativo di un farmaco somministrato o di una popolazione di cellule immunitarie, post-neutralizzazione, sulle metastasi delle cellule tumorali.
Questo protocollo ha limitazioni. Le cellule tumorali circolanti sono state selezionate per la loro capacità di metastatizzare e sono quindi non immunogenica, con livelli inferiori di maggiore di istocompatibilità di classe complessa 1 molecole. 12 Inoltre, l'introduzione improvvisa e cluster di gran numero di metastasi è diverso scenario tipico in pazienti dove un piccolo numero di cellule tumorali metastatichedissipare per un periodo prolungato di tempo dalla localizzazione del tumore primario. Inoltre, le cellule tumorali per via endovenosa introdotte sono da coltura tissutale e non di origine tumore primario. Pertanto, queste cellule sono a differenza delle metastasi secondarie che derivano da alterazioni nella adesione cellulare, la migrazione, il riconoscimento immunitario e stabilimento organo ricevente. 15,16
Un protocollo alternativo sarebbe l'iniezione sottocutanea di B16 / BL6 per la generazione di tumori primari e l'analisi delle risultanti metastasi polmonari "spontanee". Queste metastasi "spontanee" sono stati trovati per contenere più l'eterogeneità delle loro controparti "sperimentali", più strettamente corrispondono a quelli dei pazienti umani. Il protocollo è limitante nella sua capacità di determinare l'influenza di un composto sperimentale di metastasi. Con una laterale iniezione vena della coda, il numero di cellule di melanoma iniettato nel sangue può essere approssimata tramite hemocytometer. Con metastasi "spontanee", tuttavia, vi è una maggiore eterogeneità tra tumori, aggiungendo un'ulteriore variabile per il numero di foci risultante polmonare. 16
In conclusione, la B16-BL6 modello di melanoma murino vena della coda rappresenta un modello semplice per determinare l'influenza di un trattamento o immunoterapia in metastasi. In via endovenosa iniezione di cellule tumorali circolanti, i ricercatori possono replicare, in una certa misura, i pazienti post-metastasi. Considerando gli effetti distruttivi delle cellule tumorali metastatiche nei pazienti affetti da cancro, questo modello è un potente strumento per la comprensione del processo multistep di metastasi.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supportato in parte da una sovvenzione del National Cancer Institute 1R03CA172923.
Materials
| Trypsin | Corning | MT25052CV | |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT15040CM | |
| Phase Contraast Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | |
| Micro-Fine IV Insulin Syringes | BD | 14-829-1D | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Mouse Restrainer | Braintree Scientific | NC9999969 | Restrainer choice depends on age/size of mice |
| Heating Pad | Harry Schein | NC0012697 | Optional |
Referenzen
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