הזרקה של תאים syngeneic Murine מלנומה מנת לקבוע את פוטנציאל גרורתי שלהם בתוך הריאות
Summary
Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.
Abstract
Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating “experimental” metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.
Introduction
גרורה היא אחד הגורמים העיקריים למוות בקרב חולים עם ממאירויות. תהליך הפצת גרורתי של תאים סרטניים הוא הבין היטב אך נראה לערב כמה צעדים, כולל פלישה של הרקמות הסמוכות, intravasation לתוך lymphatics ואת כלי הדם, הישרדות טרנסלוקציה בתוך מערכת הדם, extravasation מן כלי הדם באתר של גרורות, הסתגלות אל המיקרו-הסביבה החדשה של האתר החדש, וההתנחלות באתר החדש על ידי התפשטות היווצרות של גידולים משניים. 1 כל אחד אירועים ביולוגיים אלה כרוכים תאי טרנספורמציה, ההפצה וההישרדות של גידול גרורתי. לדוגמא, את הטרנספורמציה של פנוטיפ אפיתל של התאים הסרטניים לתוך פנוטיפ mesenchymal, יחד עם האינטראקציה המוצלחת עם מטריקס, לאפשר להם לפלוש לרקמות סמוכות ולשלוח גרורות לחלקים אחרים של הגוף. 2,3 זאת ועוד, גרורתי אלה תאיםחייב לשרוד בתוך הדם במחזור להתחמק מעקב חיסוני מהמארח. 4,5 לבסוף, כאשר מושתלים באתר מרוחק בגוף, תאי הגידול חייבים להסתגל microenvironment שלהם כדי להתרבות וליצור גידולים משניים. 6,7 לכן , אם כי גרורות היא תופעה נפוצה בקרב חולי סרטן, יש תאים סרטניים עם גרורות באזורים מרובים של פגיעות כי ניתנים התערבות טיפולית.
בהתחשב באופי של מלנומה immunogenic, ואת הריבית האחרונות immunotherapies, מודלים למלנומה מועילים יותר ויותר. 8 בארצות הברית לבדה, מלנומה הוא הגורם של 9,000 מקרי מוות בשנה. 9 המיקומים הנפוצים של גרורות מלנומה עצמות, מוח , כבד וריאות. רוב גרור לאתרים מרוחקים להתרחש דרך מחזור הדם. תאים סרטניים במחזור בדם חייב להתחמק אישור חיסון, להגיע למיטת נימים של איבר דיסטלילפלוש דרך תאי האנדותל של כלי הדם על מנת לבסס את עצמם בהצלחה. 4-7,10, 11
כדי לחקות את לתופעה שכיחה ארסית של גרורות, שורת תאים בעכברים B16-BL6 נוצר. המנוחה של הקו הסלולרי מלנומה הורית C57BL / 6 B16-F0, B16-BL6 הוא התוצר הסופי של 10 בחירות רצופות עבור גרורות ריאה מן הזרקה תוך ורידית (וכתוצאה מכך B16-F10), ואחריו 6 בחירות רצופות לחדירה קרום השלפוחית. 12 ככזה, הוא קו התא מלנומה אמין להקמת מוקדי גרורתית העכבר, במיוחד כאשר הוא מוזרק לווריד. 13
לאחר הזרקה של כמות מספקת של תאי B16-BL6 לווריד הזנב של העכבר B57BL / 6, ואחריו שבועיים או יותר כדי לאפשר השתלה וצמיחה של תאים B16 / BL6, מוקדים גרורתי יהוו בתוך הריאות. לאחר המתת חסד ובדיקה על ידי מיקרוסקופ לנתח, מספרניתן לכמת כיום מוקדים בודדים. זה, בתורו, יכול לשמש כדי להקים אפקט מנה-גרור, כמו את מספר תאי B16-BL6 מוזרקים בקורלציה עם מספר המוקדים נוצרו על פני השטח של הריאות. מודל זה ידוע בשם "גרורות ניסיון," שבו תאים-גרורתי ידועה מוצגים ישירות לתוך זרם הדם, להקל על התפשטות מהירה וצפויה והקמה של הריאות, הכבד, או אורגן אחר של חקירה. זאת בניגוד ל "גרורות ספונטניות," שבו תאים סרטניים מושתלים, לעתים קרובות מתחת לעור, וגרורות מקורן אורגני לשפוך תאים סרטניים. 14,15
חשוב להזריק כמות מתאימה של תאי B16 / BL6 לתוך ורידי הזנב של העכברים. יותר מדי, ואת הריאות תכוסינה עם גרורות ומוקדי שכנות יהיו נבדלים אחד אחרת. מעט מדי, ואת ההשפעה של סוכן טיפולי תהיה סמויה עקב Vari טמוןations בין זריקות. על מנת לקבל מספר אופטימלי של מוקדים על הריאות של C57BL / 6 עכברים, יש צורך לתאם את מספר התאים הוזרקו בכמות מוקדים גרורתי, שהתבססו על משטח של הריאות תוך לקיחה בחשבון את distinguishability של הפרט מוקדים. פרוטוקול זה יהיה להדגים מודל מלנומה בעכברים גרורתי לעכברים C57BL / 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאים סרטניים במחזור מתוך הזרקה לוריד זנב לייצג את הגרורות כי להתחמק אתרים של צמיחה עיקרית ולהעביר דרך נתיבים כמו מחזור הדם או מערכת הלימפה, מדי פעם ומתבסס על המיטות נימי של למקומות מרוחקים. 14 הפרוטוקול המתואר לעיל משמש כמודל עבור משני גרורות. עם מספר אופטימלי של תאי B16-BL6 המוזרק, הנסיינים יכולים לקבוע את ההשפעה היחסית של תרופה מנוהלת או אוכלוסיית תא חיסון, שלאחר ניטרול, על גרורות של תאים סרטניים.
פרוטוקול זה יש מגבלות. תאי הגידול במחזור נבחרו על יכולותיהם הגרורות ולכן הם בלתי immunogenic, שיש רמות נמוכות של 1 מולקולות מורכבות המרכזי histocompatibility בכיתה. 12 יתר על כן, את ההקדמה הפתאומית באשכול של מספר רב של גרורות היא בניגוד התרחיש האופייני בחולים שם מספר קטן של תאים סרטניים עם גרורותלהפיג פני תקופה ממושכת של זמן ממיקום הגידול הראשוני. בנוסף, התאים הסרטניים לוריד הציגו הן מתרבות רקמות ולא ממקור גידול ראשוני. לכן, תאים אלה הם בניגוד הגרור מהשניים הנובעים שינויי הידבקות תא, הגירה, הכרה חיסונית ומערכת איבר נמען. 15,16
פרוטוקול חלופי יהיה הזרקה תת עורית של B16 / BL6 עבור הדור של גידולים ראשוניים ועל ניתוח של ריאתי גרורות "ספונטנית" שהתקבל. אלה "ספונטנית" גרורות נמצאו להכיל יותר הטרוגניות מאשר עמיתיהם "ניסיוני" שלהם, יותר שלהן תואמות לאלה של חולים אנושיים. הפרוטוקול הגבלה ביכולתה לקבוע את ההשפעה של תרכובת ניסיוני על גרורות. עם הזרקה לוריד זנב לרוחב, מספר תאים מלנומה מוזרקים לתוך זרם הדם יכול להיות מקורב באמצעות hemocytometer. עם גרורות "ספונטניות", לעומת זאת, ישן הטרוגניות רבה בין גידולים, הוספת משתנה נוסף למספר וכתוצאה מכך מוקדי ריאות. 16
לסיכום, המודל מלנומה בעכברים B16-BL6 וריד הזנב מהווה מודל פשוט לקביעת ההשפעה של טיפול או טיפול חיסוני על גרורות. על ידי לוריד הזרקת תאים סרטניים במחזור, חוקרים יכולים לשכפל, במידה מסוימת, חולים לאחר גרורות. שוקל את ההשפעות ההרסניות של תאים סרטניים גרורתי בין חולי סרטן, מודל זה הוא כלי רב עוצמה להבנת תהליך רב שלבי של גרורות.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמך בחלקו על ידי מענק המכון הלאומי לסרטן 1R03CA172923.
Materials
| Trypsin | Corning | MT25052CV | |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT15040CM | |
| Phase Contraast Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | |
| Micro-Fine IV Insulin Syringes | BD | 14-829-1D | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Mouse Restrainer | Braintree Scientific | NC9999969 | Restrainer choice depends on age/size of mice |
| Heating Pad | Harry Schein | NC0012697 | Optional |
Referenzen
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis. Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).
- Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease. Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).
- Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression. J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).
- Kang, Y., Massague, J. Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis. Cell. 118, 277-279 (2004).
- Hodi, S. F., et al. Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma. NEJM. 363 (13), 711-723 (2002).
- Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States. J. Am. Acad. Dermatol. 65, 133-143 (2011).
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).
- Weinberg, R. A. Is metastasis predetermined. Mol. Oncol. 1 (3), 263-264 (2007).
- Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials. Cancer Res. 56 (4), 875-879 (1996).
- Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406, 532-535 (2000).
- Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M. Tumor cell metastasis. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 5 (2), 87-114 (1986).
- Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Curr Protoc in Cell Biol. , (2001).
- Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review). Int. J. Oncol. 18 (4), 669-681 (2001).
- Hart, I. The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma. Am J Pathol. 97 (3), 587-600 (1979).
- Overwijk, W. W., Restifo, N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma. Curr Protoc Immunol. 20 (1), (2001).
