Isolamento e diferenciação de células tronco derivadas de tecido adiposo de Suínos Subcutânea tecidos adiposos

Nota: Este método tem sido estabelecidos e utilizados em pesquisas relatado anteriormente 14-17 a este laboratório; ao longo do tempo a metodologia foi modificada. O actual procedimento foi realizado utilizando uma média de 60 g de tecido adiposo subcutâneo suína de um leitão (7 a 9 dias de idade) com sementeira em placas de 6 poços de cultura de tecidos. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente a menos que designado de outra forma. Todas as experiências com animais foram aprovados pelo Comitê de Animal Institucional Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade Nacional de Taiwan. 1. Prepare Digestão Médio Obter tecidos adiposo subcutâneo do pescoço e costas; 40 a 80 g por leitão (7 a 9 dias de idade), dependendo do tamanho dos porcos. Aqui, use 60 g de tecido adiposo subcutâneo obtidos a partir de um porco. Preparar o meio digestão: pesar colagenase II em pó com um total de 54.000 unidades e dissolvê-lo em 90 ml Modified Eagle Médium da Dulbecco (DMEM,para 60 g de gordura) num frasco de 100 ml serológica (900 unidades de colagenase / 1,5 ml de DMEM / g de gordura). Agitar suavemente o meio de digestão num agitador de tapete (100 rpm) durante pelo menos 15 min para dissolver e depois passar o meio de digestão através de um filtro de 0,22 um para esterilização. Armazenar a 4 ° C antes do uso. 2. Dissecar adiposo subcutâneo tecidos de suínos Esterilizar todos os instrumentos, vidro e utensílios de plástico e quente toda a mídia para 37 ° C antes do uso. Sacrificar o leitão com elétrica sangria deslumbrante e ou usando um método de acordo com as regulamentações locais IACUC. Realizar dissecção cuidadosa e imediatamente após os leitões são sacrificados. Coloque o leitão sobre uma mesa cirúrgica limpa (de volta para cima e barriga para baixo). Raspar o cabelo do leitão volta remover todos os pêlos do pescoço à cauda e em ambos os lados para baixo para a linha média. Esfregar a pele dorsal do porco com 7,5% de povidonaiodo três vezes (com três novos-esfrega independentes) e, em seguida, permitir que o iodo para sentar-se na superfície da pele por cerca de 10 min. Remova a iodopovidona com vários sprays de 70% de etanol. Use compressas de gaze ou papéis de tecido contendo 70% de etanol para limpar a pele numa direcção, sendo repetido até não se observa qualquer cor óbvia de povidona-iodo. Use um bisturi para separar a camada dorsal de gordura suína em tecidos adiposos subcutâneos, juntamente com a camada de pele em anexo dos músculos, mantendo-se a gordura e pele usando uma pinça. mergulhar imediatamente a camada de gordura dos tecidos adiposos subcutâneos com a pele ligado num copo esterilizado (200 ml) contendo DMEM isento de soro. Pulveriza-se a fora da proveta contendo a camada de gordura com 70% de etanol e no lugar de um capuz de cultura de célula de fluxo laminar. Coloque uma grande (40 cm x 30 cm) esterilizado folha de cobertura de camada tripla na capa. [Uma camada tripla é usado para assegurar a integridade contínua.] Coloque otecido com a pele virada para baixo sobre a folha de rosto. Aparar o tecido muscular remanescente fora do tecido adiposo usando fórceps e tesouras para evitar a contaminação com o tecido do músculo. Cortar a gordura em pedaços quadrados (~ 7 cm x 7 cm) com um bisturi ou tesoura. Colocar estas partes da camada de gordura para um novo recipiente esterilizado (200 ml) contendo DMEM isento de soro. Definir um suporte de fatia personalizado na folha de cobertura montado com uma lâmina de cortador de aço de carbono (Figura 1). Pegue um pedaço de gordura para fora do copo e coloque-o na (camada de pele na camada superior e gordura abaixo) slicer. Cortar a camada de gordura do tecido adiposo subcutâneo em aproximadamente um milímetro de espessura peças. Cortar a camada de gordura da pele tão próxima quanto possível, mas evitar cortar a pele. Mince cortado tecidos adiposos com uma tesoura o mais fino possível. Adicionar meio de digestão contendo colagenase filtrada para um balão de Erlenmeyer de 250 mL ou um frasco com serológica picadatecidos adiposos (54.000 unidades de colagenase / 90 ml DMEM / 60 g de gordura). Incubar e agitar o frasco de Erlenmeyer a 45 rpm num agitador orbital durante 90 min a 37 ° C para permitir a colagenase para digerir os tecidos. Nota: Verifique a cada 15 a 30 minutos para evitar o excesso de digestão. O processo de digestão é completada se o meio de digestão é uma pasta sem aglomerados de tecido significativos. Adicionar um volume igual (igual ao meio de digestão) de meio de cultura contendo DMEM / F12 com 10% de soro fetal de bovino (FBS) para parar a digestão com colagenase. Figura 1. Um cortador de personalização utilizados para o isolamento de pADSC. Dissecada de tecidos adiposos dorsais porcino tecidos adiposo subcutâneo são compostos da camada de gordura da pele com camadas unidas. Um cortador é necessário para cortar a camada de gordura de aproximadamente 1 mm de espessura e evitar a excessivacorte em camadas da pele. Da esquerda para a direita: o titular fatia, almofada slicer, lâmina de carbono cortador de aço, e os parafusos. Lâmina Slicer é inserido entre o titular fatia e pad slicer quando montado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 3. Recolha de pADSC da fracção do estroma-vascular Passar o meio de digestão contendo os tecidos adiposos digeridas por meio de uma única camada de tecido de seda para um Erlenmeyer de 250 mL esterilizado frasco limpo ou um frasco de 250 ml serológico. Use uma pinça para pressionar a meio do chiffon para orientar e auxiliar a passagem do digerir. Escorra e torcer o chiffon com uma pinça para completar a passagem. Distribuir o meio de digestão em quatro tubos de 50 ml de centrífuga cónicos (~ médias 40 ml por tubo). Centrifuga-se a 700 xg durante 10 min para recolher o sedimento de células do estroma vascular. <li> Decantar o sobrenadante sem perturbar os sedimentos para remover a maior parte da camada de topo contendo gordura adipócitos maduros. Lava-se a pelete por adição de 10 ml de DMEM a cada tubo para ressuspender o sedimento com pipetagem e agitação suave do tubo. Centrifugar a 700 g durante 6 min. Decantar o sobrenadante. Adicionar 10 ml de tampão de lise ACK e em seguida ressuspender o sedimento por pipetagem. Deixar repousar durante 7 minutos (5 a 10 min) à temperatura ambiente para lisar as células vermelhas do sangue na fracção do estroma vascular. Adicionar quantidades iguais de DMEM (10 ml) para parar a reacção com agitação suave do tubo, e depois centrifugar a 700 xg durante 10 min. Decantar o sobrenadante, adicionar 10 ml de DMEM a cada tubo, ressuspender o sedimento com pipetagem repetida, e centrifugar a 700 xg durante 6 minutos. Repita duas vezes. Recolha e passar o DMEM (total de 40 ml DMEM a partir de 4 tubos representativas de 60 g de gordura) com células em suspensão através de um filtro de 100 um em um novo tubo de 50 ml. Gentilmente medi pipetaUM várias vezes para misturar bem e alíquota de 20 ul de meio contendo células misturada com 180 ul de solução de azul de tripano a 0,4% (diluição 1:10) em um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml. Contar as células com um hemocitómetro e, em seguida, pADSC semente a uma densidade de 60.000 células / cm2 num tamanho desejado da placa de cultura ou placa com meio de cultura contendo DMEM / F12, 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de antibióticos de penicilina solução B -streptomycin-anfotericina (P / S / A). Geralmente, a semente pADSC sobre as placas de 6 poços para cultura de tecidos de adipócitos ou diferenciação osteócito. Semear o pADSC em pratos de 10 cm para coloração marcador de superfície de células-tronco ou a diferenciação de condrócitos. Incubar as placas ou pratos no 37 ° C em incubadora de ar com 5% de CO 2 para permitir a fixação das células às placas. 4. Identificação marcadores de superfície de células-tronco de pADSC por citometria de fluxo Após 24 horas, retire o meio completamente, lave the 10 cm de placa duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e células de colheita com 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA durante 5 minutos a 37 ° C. Neutralizar tripsina-EDTA com quantidades iguais de meio de cultura (1 ml), recolher as células em um novo tubo cónico de 15 ml, e, em seguida, centrifugar a 400 x g durante 7 minutos. Decantar o sobrenadante. Lava-se a pelete duas vezes em 3 ml de tampão de SBF-lavagem arrefecido com gelo (PBS contendo 10% de FBS) usando re-suspensão por pipetagem acoplado com centrifugação a 400 xg durante 7 minutos. Ressuspender, contar, e ajustar a pADSC 10 6 células / ml em tampão de SBF-lavagem arrefecido com gelo. células de localização (100 ul / cada tubo) em vários novos tubos cónicos de 15 ml e incuba-se tubos contendo pADSC a 4 ° C durante 30 min com anticorpos contra ambos os CD4a conjugado com ficoeritrina (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE ou de MHC II-PE para a coloração directa. Parar a reacção por lavagem das células duas vezes em 10 ml de tampão de SBF-lavagem juntamente com 400 × g centrifugatíon para 7 min. Fix e ressuspender as células em tampão de fixação (PBS com 0,01% de FBS e 1% de formaldeído) para citometria de fluxo de acordo com as instruções do fabricante e a nossa publicação anterior 18. 5. Diferenciação de pADSC em adipócitos, osteócitos e condrócitos A diferenciação de adipocitos em pADSC Prepare meio de indução de adipócitos e meio de manutenção dos adipócitos Por meio de indução de adipócitos, preparar 1 L de livre de soro de DMEM / F12 (com antibióticos de 1% de P / S / A) contendo o seguinte: 1 ml de caldo de insulina (10 mg / ml de tampão de HEPES, pH 8), concentração final = 10 ug / ml; estoque 1 ul T3 (3,3 ', 5-triiodo-L-tironina, 1 mM em DMSO), concentração final = 1 nM; Da transferrina 200 uL (50 mg / ml de H 2 O destilada duas vezes), ácido clorídrico cone definitiva = 10 ug / ml; 100 ul da dexametasona (10 mM em etanol), concentração final = 1 uM; 100 ul da rosiglitazona (10 mM em DMSO), concentração final= 1 uM. Prepare meio de manutenção dos adipócitos com as mesmas adições como o meio de indução, mas com omissão de dexametasona. processo de diferenciação de adipócitos Nota: Após espalhar pADSC em placas de 6 poços, pADSC será confluentes em 72 h. Após 3 dias, remover completamente o meio e, em seguida, adicionar 3 ml de meio de indução de adipocitos em cada poço. Voltar as placas para a incubadora. Este é o dia zero de diferenciação. Após 3 dias, remover o meio de indução de adipócitos completamente e substitua com 3 ml de meio de manutenção de adipócitos de três em três dias. adipócitos maduros será terminalmente diferenciadas em cerca de 9 dias. Mais de 90% dos adipócitos são bem diferenciadas com este protocolo. Estes adipócitos estão prontos para Oil Red O coloração. Diferenciação de pADSC em osteócitos Prepare meio de indução osteócito: mediu cultura completom (DMEM / F12 com 10% de FBS e 1% de P / S / A) contendo 1 uM de dexametasona, mM β-glicerofosfato 10 e 50 ug / ml de ascorbato-2-fosfato. processo de diferenciação para osteocytes Nota: Após espalhar pADSC em placas de 6 poços, pADSC será confluentes em 72 h. Após 3 dias, remover completamente o meio e adicionar 3 ml de meio de indução osteócito em cada poço. Voltar as placas à temperatura de 37 ° C incubadora. Este é o dia zero de diferenciação. Substitua-o por meio de indução osteócito cada três dias. osteocytes maduros formará por 14 dias de diferenciação. Estes osteócitos estão prontos para Alizarina S coloração. Diferenciação de pADSC em condrócitos Prepare meio de indução de condrócitos: aMEM contendo 1% de FBS, 6,25 ug / ml de insulina, 50 ^ g / ascorbato-2-fosfato ml, e 10 ng / ml de factor de crescimento transformante-β1. processo de diferenciação de condrócitos <ol> Após espalhar pADSC em placas de cultura de 10 cm, durante 24 h, remover o meio de cultura completamente e lavar pratos duas vezes com PBS. Tripsinizar pADSC com 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA durante 5 minutos, e depois neutralizou-se com meio de cultura de 1 ml. Recolha, contar e ajustar pADSC em tubos de 15 mL cónico, com uma densidade de 2,5 x 10 5 células por tubo. Use um hemocitômetro para contar as células. Após centrifugação a 400 x g durante 7 minutos, rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento e adicionar 1 ml de meio de indução de condrócitos em um tubo de 15 ml. O tubo é devolvido à 37 ° C incubadora. Este é o dia zero de diferenciação. Substituir o meio de indução de condrócitos de três em três dias, sem a remoção de células na parte inferior. condrócitos maduros irá formar em aproximadamente 14 dias. Estes condrócitos estão prontos para o Azul de Toluidina O coloração. 6. Coloração de adipócitos diferenciados, Osteocytes e condrócitos Oil Red O para coloração adipócitos diferenciados No dia 9, remover o meio de manutenção de adipocitos em 6 poços de cultura de placas com adipócitos diferenciados e, em seguida, lava-se a placa duas vezes com PBS. [Nos passos seguintes, designadas adicionar reagentes suficientes para cobrir cada poço da placa de 6 poços.] Fix adipócitos com solução de formalina a 10% durante pelo menos 10 min. Remover a solução de formalina a 10% e lava-se a placa duas vezes com água duplamente destilada. Depois de duas lavagens, adiciona-se 100% de propileno glicol para a placa de cultura e deixar repousar durante 1 min. Remover a 100% de propileno glicol e, em seguida, adicionar solução de Oil Red O (0,5% em propilenoglicol) à placa de cultura. Deixe repousar por pelo menos 10 min num agitador oscilante com agitação suave (100 rpm). Remover a solução de Oil Red O e, em seguida, substitua-o por 60% de propileno glicol. Deixe repousar por 1 min. Remover a 60% de propileno glicol e, em seguida, lava-se a placa duas vezes com dágua ouble-destilada. Substitua com solução de formol a 10%. As gotículas lipídicas manchadas dentro dos adipócitos estão prontos para a observação por microscopia de luz. Quantificação de intracelular Oil Red O (passos opcionais abaixo): após observação microscópica, remover 10% de solução de formalina e lavar a placa duas vezes com água duplamente destilada. Drenar a placa completamente e adicionar 500 mL de isopropanol para a placa de 6 poços. Deixe isopropanol ficar na placa de 6 poços, num agitador basculante suave (100 rpm) durante pelo menos 10 min para dissolver o corante Oil Red O. de Aspirar o isopropanol contendo Oil Red O e distribuir sobre uma placa de 96 poços. Quantificar o extraído Oil Red O utilizando uma leitura espectrofotométrica a 510 nm. coloração Alizarina Red S para osteocytes diferenciado No dia 14, remover o meio de indução osteócito a partir de placas de 6 poços com osteócitos diferenciadas e lavar as placas duas vezes com PBS. [Nos following passos, adicionar os reagentes designados suficientes para cobrir cada poço da placa de 6 poços.] Fix osteócitos em solução de formalina a 10% durante pelo menos 10 min. Remover a solução de formalina a 10% a partir de cada cavidade e lavar a placa duas vezes com água duplamente destilada. Depois de duas lavagens, adiciona-se 2% de solução de vermelho de alizarina S (pH = 4,1-4,3) para a placa de 6 poços e deixar repousar durante pelo menos 15 minutos num agitador basculante suave (100 rpm). Remover a solução de Vermelho de Alizarina S e, em seguida, lava-se a placa duas vezes com água duplamente destilada. Substitua com solução de formol a 10%. Osteócitos estão prontos para a observação por microscopia de luz. Azul O coloração Toluidine para condrócitos diferenciados No dia 14, o meio de indução de condrócitos aspirado a partir do tubo de 15 ml sem remover sedimentos de condrócitos diferenciados na parte inferior do tubo e lavar o tubo, duas vezes com PBS. [Nas etapas a seguir, adicionar os reagentes designados suficientes para coveR condrócitos no fundo do tubo ou sobre a secção de corrediça.] Fix condrócitos em solução de formalina a 10% durante pelo menos 10 min. Remover a solução de formalina a 10% a partir de cada tubo de lavagem e o tubo, duas vezes com água duplamente destilada. Depois de duas lavagens, pastilhas incorporar em OCT e Composto secção com um criostato com uma espessura de 5 um. Manchar o slide das seções criostato com Azul de Toluidina O solução (0,1% com pH 4.1). Remover Azul de Toluidina O solução e, em seguida, lava-se a secção de duas vezes com água duplamente destilada. Nota: Os condrócitos em slides estão prontos para a observação por microscopia de luz.