隔离和脂肪干细胞分化的猪从皮下脂肪组织

注意：此方法已经建立，并在研究中使用先前报道的来自这个实验室14-17;随着时间的推移的方法进行了修改。使用60g的猪皮下脂肪组织的平均从一个仔猪（7-9天龄）与6孔组织培养板中接种，进行当前过程。在RT，除非另有指定进行的所有过程。所有动物实验的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在台大批准。 1.准备中消化获得从颈部和背部的皮下脂肪组织; 40至80％的仔猪克（7-9天龄），视猪的大小。在这里，使用60克从一头猪获得皮下脂肪组织中。 制备消化介质：称胶原酶II粉末共54,000单位和在90ml的Dulbecco改良Eagle培养基溶解（DMEM，在100毫升血清瓶中60克脂肪）（900个单位的胶原酶/ 1.5的10ml DMEM / g的脂肪）。 轻轻搅动上的振动台（100转）消化介质至少15分钟以溶解，然后通过0.22μm过滤器进行灭菌通过消化介质。使用前在4℃保存。 2.解剖皮下脂肪组织从猪在使用前消毒所有仪器，玻璃和塑料制品和温暖所有的媒体至37℃。 牺牲与电击晕和放血或通过根据本地IACUC规使用的方法中的仔猪。仔细立即执行清扫仔猪被牺牲了。 躺在干净的手术台上的小猪（背面朝上和腹部向下）。从仔猪背面除去从颈部所有头发尾部和两侧向下中线剃去毛发。 擦洗7.5％聚维酮猪的背部皮肤碘三次（具有三个新的独立-磨砂），然后使碘坐皮肤的表面上约10分钟。 用70％乙醇的多个喷雾剂除去碘伏。用纱布垫或含70％的乙醇擦拭皮肤在一个方向上，重复直到碘伏没有明显的颜色被观察到的组织的文件。 使用手术刀皮下脂肪组织的猪背脂肪层与来自肌肉，同时使用镊子皮肤阻碍了脂肪和连接的皮肤层一起分离。 立即浸入附着皮肤的皮下脂肪组织中的脂肪层在含有无血清DMEM的无菌烧杯（200毫升）中。 喷洒含有用70％的乙醇和发生在一个层流细胞培养罩脂肪层烧杯的外部。放置一个大（40厘米×30厘米）灭菌三层盖处于罩箔。 [A三层是用来确保持续的完整性。] 放置组织与皮肤朝下到盖箔。 修剪剩余肌肉组织关闭使用镊子和剪刀，以避免与肌肉组织的污染的脂肪组织的。 切脂肪转化为见方的小块（〜7厘米×7厘米）用手术刀或剪刀。将这些碎片脂肪层进入含无血清DMEM新灭菌烧杯（200毫升）中。 上设置与碳钢切片机刀片（ 图1）装配在覆盖箔定制片保持器。拿一块肥肉了烧杯，并把它切片机（下面顶部和脂肪层皮肤层）。 切片皮下脂肪组织的脂肪层到大约1mm厚的片。切片从皮肤尽可能接近脂肪层，但避免切片皮肤。 剁碎切片脂肪组织用剪刀尽可能细。 含有胶原酶过滤消化培养基添加到250毫升三角瓶中或血清学瓶剁碎脂肪组织（54000单位胶原酶/ 90的10ml DMEM / 60克脂肪）。 孵育，并在37℃下摇动Erlenmeyer烧瓶在45转在轨道摇床90分钟，以允许胶原酶消化组织。 注意：检查每15至30分钟，以避免过度消化。如果消化培养基是无显著组织团块的浆料的消化过程完成。 添加含有DMEM / F12，用10％胎牛血清（FBS）的培养基等体积（等于消化培养基）以停止胶原酶消化。 从猪背部皮下脂肪组织图1.用于pADSC的隔离定制的限幅器。解剖的脂肪组织组成附着皮肤层的脂肪层。切片机需要切片脂肪层约为1毫米厚与避免过度切片进入皮肤层。从左至右依次为：切片持有人，切片机垫，碳钢切片机刀片，和螺丝。切片机刀片插入片架和组装时切片垫之间。 请点击此处查看该图的放大版本。 从间质血管分数pADSC的3集通过薄纱的单层到干净无菌250ml锥形烧瓶或250毫升血清瓶中传递包含消化脂肪组织的消化培养基。使用镊子按压雪纺中间的指导和协助消化通过。 排水和捻雪纺用镊子来完成通道。 分发消化介质分为四个50ml锥形离心管（每个管40毫升培养基）。 离心机在700×g离心10分钟以收集基质血管细胞的沉淀。 <li>倒出上清，而不会干扰颗粒除去大部分含有成熟脂肪细胞上的脂肪层。通过加入10ml的DMEM到每个管中重悬以移液和管轻轻摇动沉淀洗涤沉淀。 离心在700 xg离心6分钟。倒出上清液。 加入10 mL ACK裂解液，然后悬浮吹打沉淀。让它静置在RT 7分钟（5至10分钟）以裂解红血细胞中的基质血管级分。 添加的DMEM（10毫升）中的等量停止与管轻轻摇动反应，然后在700 xg离心离心10分钟。 倒出上清液，加入10 mL的DMEM到每个管中，重悬反复吹打沉淀，并离心分离，在700×g离心6分钟。重复两次。 收集并通过100微米的过滤器通过与悬浮的细胞的DMEM（从代表60克脂肪4管总为40ml DMEM）到一个新的50ml锥形管中。 轻轻吸管MEDI嗯几次在一个新的1.5毫升的微量试管拌匀等分试样20微升180微升的0.4％台盼蓝溶液（1:10稀释）混合含有细胞的培养基。 计数与血球然后种子pADSC将细胞在60,000个细胞/ cm 2的密度到培养皿或板用含有DMEM / F12，10％胎牛血清（FBS）和青霉素的1％的抗生素的培养基所希望的大小-streptomycin-两性霉素B溶液（P / S / A）。一般地，种子上为脂肪细胞或骨细胞分化的6孔组织培养板的pADSC。种子10厘米的菜干细胞或软骨细胞分化的表面标志物染色pADSC。 孵育在37℃培养箱中空气，5％CO 2将板或菜肴，以允许细胞附着于板。 4.识别干细胞表面流式细胞仪pADSC的标记 24小时后，彻底清除介质，洗个用磷酸盐缓冲盐水（PBS），并收获细胞用1ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA的5分钟，在37℃E-10-cm培养皿两次。 中和胰蛋白酶-EDTA用等量培养基（1ml）中的，收集细胞在新的15毫升锥形管，然后在400×g下离心7分钟。 倒出上清液。在400 xg离心移液加上离心7分钟洗涤沉淀两次3毫升冰冷FCS洗涤缓冲液（含有10％FBS的PBS），使用再悬浮。 悬浮，计数，并在冰冷FCS的洗涤缓冲液调整pADSC至10 6个细胞/ ml。位置细胞（100微升/每个管）成多个新的15毫升锥形管中，并培育含有pADSC管在4℃下用抗藻红蛋白缀合的CD4A（CD4A-PE），CD29-PE，CD31-PE抗体30分钟，CD44-PE，CD45-PE，CD90-PE，MHC I-PE或MHC II-PE直接染色。通过在10毫升的FCS的洗涤缓冲液加上400×g下centrifugat洗涤细胞两次终止反应离子为7分钟。 固定，并根据制造商的说明，我们的先前出版物18悬浮在固定缓冲液的细胞（PBS含0.01％FBS和1％甲醛）进行流式细胞。 5.分化pADSC的成脂肪细胞，骨细胞和软骨细胞 pADSC分化成脂肪细胞准备脂肪细胞诱导培养基和脂肪细胞维持培养基为脂肪细胞诱导培养基，制备1升的无血清的DMEM / F12（具有1％的抗生素的P / S / A）含有以下内容：1毫升胰岛素库存（10毫克/毫升的HEPES缓冲液，pH 8），终浓度= 10微克/毫升; 1μl的T3库存（3,3'，5-三碘左旋甲腺氨酸，1mM的在DMSO中），终浓度= 1nM的; 200微升转股票（50毫克/毫升双蒸H 2 O），终浓度= 10微克/毫升; 100微升地塞米松原料（10毫米乙醇），终浓度= 1μM; 100微升罗格列酮的股票（10毫米DMSO），终浓度= 1μM。 制备脂肪细胞维持培养基使用相同的增补的诱导培养基，但与地塞米松的遗漏。 对于脂肪细胞分化过程注意：在6孔板接种pADSC后，pADSC将72小时内汇合。 3天后，完全除去介质，然后添加3毫升脂肪细胞诱导培养基的每孔。返回所述板的孵化器， 这是分化的零天。 3天后，完全除去脂肪细胞诱导培养基并用3ml的脂肪细胞维持培养基的每三天更换。成熟脂肪细胞将约9天终末分化。脂肪细胞的90％以上都采用这种协议高分。这些脂肪细胞已经准备好油红O染色。 pADSC分化成骨细胞准备骨细胞诱导培养基：完全培养mediu米（DMEM / F12有10％FBS和1％P / S / A），含有1μM的地塞米松，10mM的β-甘油和50μg/ ml的抗坏血酸-2-磷酸。 对骨细胞分化过程注意：在6孔板接种pADSC后，pADSC将72小时内汇合。 3天后，完全除去介质并加入3毫升骨细胞诱导培养基的每孔。返回所述板到37℃培养箱。这是分化的零天。 与骨细胞诱导培养基替换每三天。成熟的骨细胞将分化后的14天内形成。这些骨细胞已经准备好茜素红S染色。 pADSC分化为软骨细胞制备软骨细胞诱导培养基：含有αMEM1％FBS，6.25微克/毫升的胰岛素，50μg/ ml的抗坏血酸-2-磷酸，和10ng / ml的转化生长因子β1。 软骨细胞分化过程<ol> 上10厘米培养皿播种pADSC 24小时后，完全除去培养基并用PBS洗碗两次。 Trypsinize pADSC用1ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA的5分钟，然后中和用1ml培养基。收集，计数并在15ml锥形管中，每管2.5×10 5个细胞的密度调整pADSC。使用血细胞计数器计数细胞。 在400×g下进行7分钟离心后，弃去上清液而不扰乱小球，并在15毫升管加入1ml软骨细胞诱导培养基。该管被返回到37℃培养箱。这是分化的零天。 更换软骨细胞诱导培养基每三天没有在底部移除细胞。成熟软骨细胞将形成在大约14天。这些软骨细胞准备好甲苯胺蓝O染色。 6.有区别的脂肪细胞，Osteocy染色TES和软骨细胞油红O染色脂肪细胞分化在第9天，除去脂肪细胞维持培养基中分化的脂肪细胞的6孔培养板，然后用PBS洗涤板两次。 [在以下步骤中，添加足够的指定的试剂，以覆盖6孔板的每个孔中。] 固定，用10％福尔马林溶液脂肪细胞至少10分钟。 除去10％福尔马林溶液中，用双蒸水洗涤板两次。 洗涤两次后，加入100％丙二醇的培养板并静置1分钟。 除去100％丙二醇，然后加入油红O溶液（在丙二醇中的0.5％），向培养板上。静置上轻摇（100rpm）下一个摇臂摇动至少10分钟。 去除油红O溶液，然后用60％丙二醇替换。静置1分钟。 除去60％的丙二醇，然后与D洗板两次ouble蒸馏水。 用10％福尔马林溶液替换。脂肪细胞内染色脂滴已经准备好通过光学显微镜观察。 细胞内的油红O的定量（以下可选步骤）：显微镜观察后，取出10％福尔马林溶液中，用双蒸水冲洗两次盘。 完全排空板，并添加500μl的异丙醇中，以6孔板。 让异丙醇站在6孔板上的平缓摇杆摇床（100rpm）下至少10分钟，以溶解油红O的染料吸入包含油红O的异丙醇并在96孔板分发。采用分光光度法读数在510 nm处量化提取的油红O。 茜素红S染色骨细胞分化在第14天，从分化骨细胞6孔板除去骨细胞诱导培养基，并用PBS洗涤板两次。 [在followi纳克步骤，添加足够的指定的试剂，以覆盖6孔板的每个孔中。] 固定在10％福尔马林溶液骨细胞至少10分钟。 除去从每个孔的10％福尔马林溶液中，用双蒸水洗涤板两次。 洗涤两次后，加入2％茜素红S溶液（pH = 4.1-4.3）的6孔板，静置至少15分钟，在温和摇动摇动器（100转）。 去除茜素红S溶液，然后用双蒸水洗涤板两次。 用10％福尔马林溶液替换。骨细胞已经准备好通过光学显微镜观察。 甲苯胺蓝O染色的软骨细胞分化在第14天，从15毫升锥形管吸出软骨细胞诱导培养基没有在管的底部用PBS除​​去分化的软骨细胞的沉积物和洗管两次。 [在下面的步骤，补充足够的指定试剂湾ř软骨在管子上或节幻灯片的底部。] 固定在10％福尔马林溶液软骨细胞至少10分钟。 除去从每个管的10％的福尔马林溶液中，用双蒸水洗涤管两次。 洗涤两次后，在厚度为5微米的嵌入OCT化合物中和部分用低温恒温器粒料。 染色用甲苯胺蓝O解决方案（0.1％使用pH 4.1）的冷冻切片的滑动。 除去甲苯胺蓝O解决方案，然后用双蒸水冲洗两次部分。 注：在幻灯片上软骨已经准备好通过光学显微镜观察。