Domuz Subkutan yağ dokularındaki İzolasyonu ve Yağ-Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşması

Not: Bu yöntem kurulmuş ve araştırmalarda kullanılan daha önce bu laboratuvardan 14-17 bildirilmiştir; zamanla metodoloji değişiklik yapıldı. Mevcut Prosedür 6-gözlü doku kültür levhaları üzerinde tohumlama ile (7 ila 9 gün) bir domuz yavrusu domuz deri altı adipoz dokuların 60 g ortalama kullanılarak gerçekleştirilmiştir. aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan deneyleri Ulusal Tayvan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Sindirim Orta hazırlayın ense ve gelen cilt altı yağ dokuları elde; 40 domuz yavrusu başına 80 g (7 ila 9 gün), domuz boyutuna bağlı olarak değişebilir. Burada, bir domuz elde edilen deri altı yağ dokularının 60 gr kullanın. Sindirim orta hazırlayın: (DMEM 54.000 adet olmak üzere toplam kolajenaz II toz ağırlığında ve 90 Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı mi içinde çözülür,100 ml'lik serolojik şişede 60 g yağ) (kollajenaz 900 ünite / 1.5 ml DMEM / g yağ) için. Yavaşça çözülür ve daha sonra sterilizasyon için 0.22 um filtre ile sindirim orta geçmesi için en az 15 dakika süre ile bir çalkalama tablosu (100 rpm) üzerine sindirim orta ajitasyon. Kullanmadan önce 4 ° C'de saklayın. Domuzlar 2. Dissect Subkutan Yağ Dokular Kullanmadan önce 37 ° C tüm enstrümanları, cam ve plastik eşya ve sıcak tüm medya sterilize edin. Elektrik sersemletme ve bunlar, kanları tümüyle ya da lokal IACUC düzenlemelerine uygun olarak bir yöntem kullanılarak domuz yavrusu Kurban. domuz kurban sonra dikkatli ve hemen diseksiyon. Temiz cerrahi masaya piglet Lay (sırt ve karın aşağı yukarı bakacak şekilde). orta hatta aşağı her iki tarafta kuyruk ve boyun tüm saç çıkarma piglet geri saç traş. % 7.5 povidone- ile domuz dorsal cilt fırçalayıniyot üç (üç yeni bağımsız scrubs ile) kez ve daha sonra iyot yaklaşık 10 dakika cilt yüzeyinde oturmak için izin verir. % 70 etanol birden spreyler ile povidon-iyot çıkarın. gazlı bez veya povidon-iyodin belirgin bir renk görülünceye kadar tekrarlayarak, tek yönde cildi temizlemek için% 70 etanol içeren doku kağıtları kullanın. yağ tutan ve cilt forseps kullanırken kaslardan ekli deri tabakası ile birlikte cilt altı yağ dokularının domuz dorsal yağ tabakası ayırmak için bir neşter kullanın. Hemen serumsuz DMEM içeren bir steril şişeye (200 mi) içinde eklenmiş deri ile deri altı adipoz dokuların yağ tabakası bırakın. Laminer akış hücresi kültürü kaputu% 70 etanol ve yer ile yağ tabakası içeren beher dışında püskürtün. kaputu büyük (40 cm x 30 cm) sterilize edilmiş üç katmanlı kaplama folyosunu yerleştirin. [Üçlü tabaka sürekli bütünlüğünü sağlamak için kullanılır.] Yericilt kapağı folyo üzerine aşağı bakacak şekilde doku. kas dokusu ile kirlenmesini önlemek için forseps ve makas kullanılarak yağ dokusunun kapalı kalan kas dokusu kesin. kare parçalar halinde yağ Kes (~ 7 cm x 7 cm) bir neşter veya makasla. serumsuz DMEM içeren yeni bir steril şişeye (200 mi) içine yağ tabakasının bu parçaları. Bir karbonlu çelik dilimleyici bıçak (Şekil 1) ile monte edilmiş kapak folyo üzerinde özelleştirilmiş bir dilim tutucu ayarlayın. beher dışına yağ tek parça alın ve dilimleyici (üst ve yağ tabakası altında cilt tabakasının) üzerine yerleştirin. yaklaşık 1 mm kalınlığında parçalar halinde cilt altı yağ dokularının yağ tabakası dilimleyin. mümkün olduğunca yakın deri yağ tabakası dilimleyin ama cilt dilimleme kaçının. Kıyma, mümkün olduğunca ince makasla yağ dokuları dilimlenmiş. Kıyılmış içeren 250 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi veya serolojik şişeye kolajenaz ihtiva eden filtre sindirim orta ekleyinadipoz doku (kolajenaz 54.000 ünite / 90 mL DMEM / 60 g yağ). Inkübe ve kolajenaz sindirimi dokuları izin 37 ° C'de 90 dakika boyunca bir yörüngesel karıştırıcıda 45 rpm'de bir Erlenmeyer şişesi girdap. Not: Aşırı sindirim önlemek için her 15 ila 30 dakika kontrol edin. sindirim ortamı önemli doku kümeleri olmayan bir bulamaç ise sindirim işlemi tamamlanır. kolajenaz sindirimi durdurmak için% 10 cenin sığır serumu (FBS) içeren DMEM / F12 ihtiva eden kültür ortamı (sindirim ortamına eşit) eşit hacim. Domuz dorsal deri altı yağ dokuları Şekil 1. pADSC izolasyonu için kullanılan özelleştirilmiş bir dilimleyici. Dissected adipoz dokular bağlı cilt katmanları ile yağ tabakası oluşur. Bir dilimleyici aşırı kaçınma ile yaklaşık 1 mm kalınlığında yağ tabakası dilim için gereklidirCilt katmanları içine dilimleme. dilim tutucu, dilimleyici pedi, karbon çelik dilimleme makinesi bıçak ve vidalar: Soldan sağa. Dilimleme bıçağı dilim tutucu ve montajı dilimleyici ped arasına sokulur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Stromal vasküler Fraksiyondan pADSC 3. Toplama Temiz steril 250 ml Erlenmeyer kabı içine şifon tek bir tabaka ya da 250 mi serolojik şişe ile dijeste adipoz dokuları ihtiva eden sindirim orta geçirin. rehberlik ve sindirimi geçişini yardımcı olmak için şifon orta bastırmak için forseps kullanabilir. Drenaj ve geçişin tamamlanması için bir forseps ile şifon bükün. Dört 50 ml konik santrifüj tüpleri (~ tüp başına 40 mi ortamı) sindirim orta dağıtın. 10 dakika boyunca 700 xg'de santrifüj stromal vasküler hücrelerin pelet toplamak için. <li> Olgun adipositlerin içeren üst yağ tabakasının en kaldırmak için pelet bozmadan süpernatant süzün. pipetleme ve borunun hafifçe çalkalanarak pelletini, her tüpe 10 ml DMEM ilave edilerek pelet yıkayın. 6 dakika boyunca 700 x g'de santrifüjleyin. süpernatant süzün. 10 ml ACK lizis tamponu ekleyin ve sonra pipetleme pelletini. Bu stromal vasküler fraksiyonunda kırmızı kan hücreleri lize etmek için, oda sıcaklığında, 7 dakika (5 dakika ila 10) bekletin. borunun hafifçe çalkalanarak reaksiyonu durdurun ve 10 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj DMEM (10 mi) arasında eşit bir şekilde artırmıştır. Her tüp içine 10 mL DMEM ilave, süpernatant süzün 6 dakika boyunca 700 xg'de tekrar pipetleme ile pelet ve santrifüj tekrar süspansiyon. İki kez tekrarlayın. Toplamak ve yeni bir 50 ml konik tüp içine 100 mikron süzgeç vasıtasıyla asılı hücreleri ile DMEM (60 gr yağ temsil 4 tüpler 40 ml DMEM toplam) geçmektedir. Yavaşça pipet medium birkaç kez, yeni bir 1.5 mi Eppendorf tüpü içinde de ve kısım% 0.4 tripan mavisi solüsyonu (1:10 seyreltme) 180 ul ile karıştırılmış hücre ihtiva eden bir ortamda 20 ul karıştırın. DMEM / F12,% 10 cenin sığır serumu (FBS) ve penisilin,% 1 antibiyotik içeren bir kültür ortamında kültür kabı veya plakanın arzu edilen boyutu üzerine 60.000 hücre / cm2 yoğunluğunda, bir daha sonra hemositometre ve tohum pADSC ile hücre sayımı -streptomycin-amfoterisin B çözeltisi (P / S / A). Genel olarak, adiposit ya osteosit farklılaşması için 6-çukurlu doku kültür levhaları üzerinde pADSC tohum. Kök hücreleri ya da kondrosit farklılaşması yüzey işaretleyici boyama için 10 cm'lik kaplar ile ilgili pADSC tohumu. Plakalar hücre bağlanmasına olanak sağlamak üzere,% 5 CO2 ile havada, 37 ° C kuluçka makinesi içinde kapların inkübe edin. Akış Sitometrisi ile pADSC 4. Kimlik Kök hücre yüzey belirteçleri 24 saat sonra tamamen orta kaldırmak, inci yıkamafosfat tamponlu salin (PBS), 37 ° C'de 5 dakika süreyle% 0.25 tripsin-EDTA 1 ml Hasat hücreleri ile iki kez E 10 cm'lik bir tabak. Kültür ortamında (1 mi) eşit miktarda tripsin-EDTA nötralize yeni bir 15 ml'lik konik bir tüp içinde hücreleri toplamak, ve daha sonra, 7 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj. süpernatant süzün. 7 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ile birlikte pipetle iki kez 3 ml buz soğukluğunda FCS yıkama tamponu kullanılarak tekrar süspansiyon (PBS,% 10 FBS ihtiva eden) pelet yıkayın. Tekrar süspansiyon sayısı ve buz soğukluğunda FCS yıkama tamponu içinde 10 6 hücre / ml pADSC ayarlayın. Birden çok yeni 15-ml'lik konik tüpler içine yerleştirin hücreleri (100 ul / her tüp) ve her iki fikoeritrin-konjüge CD4a (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE karşı antikorlarla, 30 dakika boyunca 4 ° C 'de pADSC ihtiva eden tüpler inkübe , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE veya doğrudan boyama MHC II-PE. FCS yıkama tamponu 400 x g centrifugat ile birlikte 10 ml hücreler iki kez yıkanarak reaksiyonu durdurun7 dakika için iyon. Fix ve üreticinin talimatlarına ve önceki yayın 18'e göre akış sitometri için (% 0.01 FBS ve% 1 formaldehit ile PBS) sabitleme tampon hücreleri tekrar süspansiyon. Adipositler, kemik ve kondrosit içine pADSC 5. Farklılaşma adipositlere pADSC farklılaşması adiposit indüksiyon orta ve adiposit bakım ortamı hazırlayın (10 mg / ml HEPES tamponu, pH 8) 1 mL arasında insülin stokları, final kons =: adiposit endüksiyon ortamı, aşağıdaki ihtiva eden (% 1 antibiyotik P / S / A) ile serumsuz DMEM / F12 1 L hazırlanması 10 ug / ml; 1 ul T3 hazır (3,3 ', 5 triiodo-L-tironin, DMSO içinde 1 mM), son konsantrasyonu = 1 nM; 200 ul transferin hazır nihai konsantrasyon = 10 ug / ml (50 mg / ml iki kez damıtılmış H2O); 100 ul deksametazon stok (etanol içinde 10 mM), final kons = 1 uM; 100 ul rosiglitazon stok (DMSO içinde 10 mM), final kons= 1 uM. indüksiyon ortamıyla aynı eklemelerle adiposit bakım ortamı hazırlayın, ama deksametazon ihmal ile. adipositler için Farklılaşma süreci Not: 6-yuvalı plakalar üzerinde pADSC tohumlama sonra pADSC 72 saat içinde birleşmiş edilecektir. 3 gün sonra, tam orta kaldırmak ve daha sonra her kuyuya adiposit endüksiyon ortamı 3 ilave edin. Inkübatör plakaları geri dön. Bu farklılaşma gün sıfırdır. 3 gün sonra, tam adiposit indüksiyon orta kaldırmak ve adiposit Bakım ortamının 3 ml üç günde ile değiştirin. Olgun adipositler ölümcül yaklaşık 9 gün ayırt edilecektir. adipositlerin% 90 üzerinde de bu protokolü kullanarak ayrılır. Bu adipositler yağ kırmızısı için hazırdır. osteositleri içine pADSC farklılaşması osteosit endüksiyon ortamı hazırlayın: Tüm kültür Mediu'yu1 uM deksametazon, 10 mM β-gliserofosfat, 50 ug / ml askorbat-2-fosfat içeren m (% 10 FBS ve% 1 P / S / A DMEM / F12). osteositleri için Farklılaşma süreci Not: 6-yuvalı plakalar üzerinde pADSC tohumlama sonra pADSC 72 saat içinde birleşmiş edilecektir. 3 gün sonra, tam orta kaldırmak ve her bir kuyuya osteosit endüksiyon ortamı 3 ilave edin. 37 ° C inkübatör plakaları dönün. Bu farklılaşmanın gün sıfırdır. her üç günde bir osteosit indüksiyon ortamı ile değiştirin. Olgun osteositlerde farklılaşma 14 gün oluşturacaktır. Bu osteositlerde Alizarin Kırmızı S boyama için hazır. kondrosit içine pADSC farklılaşması Kondrosit endüksiyon ortamı hazırlayın: αMEM% 1 FBS, 6.25 ug / mL arasında insülin, 50 ug / ml askorbat-2-fosfat içeren ve 10 büyüme faktörü-ß1 transforme ng / ml. kondrosit için Farklılaşma süreci <ol> 24 st için 10 cm'lik kültür tabakları üzerinde pADSC tohumlama sonra tamamen kültür ortamı çıkarın ve iki kez PBS ile bulaşıkları yıkama. daha sonra 1 5 dakika boyunca% 0.25 tripsin-EDTA ve ile tripsinize pADSC 1 ml kültür ortamı ile nötralize edin. Toplama, sayısı ve tüp başına 2.5 x 10 5 hücre yoğunluğunda 15 ml konik tüplerde pADSC ayarlayın. hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın. 7 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj işleminden sonra, pelet bozmadan süpernatan atılır ve 15 ml bir tüp içinde, kondrosit endüksiyon ortamı 1 ml. Tüp, 37 ° C inkübatör döndürülür. Bu farklılaşmanın gün sıfırdır. alt hücreleri çıkarmadan kondrosit indüksiyon orta üç günde değiştirin. Olgun kondrositler yaklaşık 14 gün içinde oluşacaktır. Bu kondrositlerin Toluidin Mavi O boyama için hazır. Farklılaştırılmış adipositlerinde, Osteocy 6. boyanmasıTES ve Kondrositler farklılaşmış adipositler için Yağ Kırmızı O boyama 9. günde, farklı adipositler 6 oyuklu kültür plakaları içinde adiposit bakım ortamını çıkarın ve daha sonra PBS ile iki kez plakayı yıkayın. [Aşağıdaki adımlarda, 6-çukurlu bir levhanın her çukuruna karşılamak için yeterli belirlenmiş reaktifler ilave edin.] En az 10 dakika süreyle% 10 formalin ile adiposit düzeltildi. % 10 formalin ile çıkarın ve iki kez damıtılmış su ile iki kez plakayı yıkayın. İki yıkamadan sonra, kültür plakasına% 100 propilen glikol ekleyin ve 1 dakika boyunca bekletilir. % 100 propilen glikol çıkarın ve daha sonra, kültür plakasına, Yağ Kırmızı O solüsyonu (propilen glikol içinde% 0.5) ilave edilir. yumuşak çalkalama (100 rpm) ile bir rocker çalkalayıcı üzerinde en az 10 dakika boyunca bekletin. Yağ Kırmızı O solüsyonu çıkarın ve sonra% 60 propilen glikol ile değiştirin. 1 dakika boyunca bekletin. % 60 propilen glikol çıkarın ve D ile iki kez plakayı yıkayınsu ouble-damıtıldı. % 10 formalin solüsyonu ile değiştirin. adipositlerin içinde lekeli lipid damlacıkları, ışık mikroskobu ile gözlem için hazırız. Hücre içi Yağlı Kırmızı O miktarının (aşağıda opsiyonel adım): mikroskopik gözlemlerden sonra,% 10 formalin ile çıkarın ve iki kez damıtılmış su ile iki kez plakayı yıkayın. tam plaka boşaltın ve 6 oyuklu plaka izopropanol 500 ul ekle. izopropanol, Yağ Kırmızı O seviyesinde boya çözündürülmesi için en az 10 dakika boyunca hafif bir külbütör çalkalayıcıda (100 rpm) 6-çukurlu plaka içindeki bekletin Oil Red O içeren izopropanol aspire ve 96 oyuklu bir plaka üzerinde dağıtır. 510 nm'de spektrofotometrik okuma kullanılarak çıkarılan Oil Red O niceliğini. farklılaşmış osteositlere için Alizarin Kırmızı S boyama 14. günde, farklı osteosit 6 oyuklu plakalar ile osteosit endüksiyon orta kaldırmak ve iki kez PBS ile plakaları yıkayın. [Followi iseNG 6 oyuklu plakanın her bir karşılamak için yeterli belirlenmiş reaktifleri ekleme adımları tekrarlayın.] En az 10 dakika boyunca% 10 formalin ile osteosit düzeltildi. Her kuyudan% 10 formalin ile çıkarın ve iki kez damıtılmış su ile iki kez plakayı yıkayın. İki yıkamadan sonra, 6-çukurlu plaka% 2 Alizarin kırmızı çözeltisi (= 4.1-4.3 pH) ekleyin ve yumuşak bir külbütör çalkalayıcıda (100 rpm) üzerinde en az 15 dakika boyunca bekletilir. Alizarin Kırmızı S çözüm çıkarın ve sonra çift distile su ile iki kez plaka yıkayın. % 10 formalin solüsyonu ile değiştirin. Osteositlerde, ışık mikroskobu ile gözlem için hazırız. farklı Kondroitlerin Toluidin Mavi O lekeleme 14. günde, PBS ile iki kez tüp tüp alt farklılaşmış kondrositlerin tortuların çözülmesinde ve yıkama olmadan 15 ml konik tüp aspire kondrosit indüksiyon ortamı. [Aşağıdaki adımlarda, cove için yeterli belirlenen reaktif ekleyinr Tüpün veya bölüm slayt alt kondrositler.] En az 10 dakika süreyle% 10 formalin ile kondrositlerin düzeltildi. Her bir tüpten% 10 formalin ile çıkarın ve iki kez damıtılmış su ile iki kez tüp yıkayın. İki yıkamadan sonra, 5 um kalınlığında bir kriyostat oct Bileşim ve kesit pelet yerleştirin. Toluidin Mavi O çözeltisi (pH 4.1,% 0.1) ile birlikte kriyostat bölümlere lamele. Toluidin Mavi O çözüm çıkarın ve sonra çift distile su ile iki kez bölümüne yıkayın. Not: slaytlar üzerinde Kondrositler ışık mikroskobu ile gözlem için hazırız.