돼지 피하 지방이 조직에서 분리 및 지방이 유래 줄기 세포의 분화

참고 :이 방법은 설립과 연구에 사용 이전에이 실험실 14-17을보고되었다; 시간이 지남에 따라 방법은 수정되었습니다. 현재의 절차를 6 웰 조직 배양 플레이트에 시딩으로 (7 일 9 개월) 한 돼지에서 돼지의 피하 지방 조직의 60g의 평균을 사용하여 수행 하였다. 달리 지정하지 않는 한 모든 절차는 실온에서 수행 하였다. 모든 동물 실험은 국립 대만 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 1. 소화 매체 준비 다시 목의 피하 지방 조직을 얻기; 돼지 당 40 g 80 (7 ~ 9 일 이전)은 돼지의 크기에 따라. 여기, 한 돼지에서 얻은 피하 지방 조직의 60g를 사용합니다. 소화 매체를 준비합니다 (DMEM을 54,000 단위의 총 콜라게나 제 II 분말의 무게를 90 둘 베코의 변형 이글 중간 가하여을 용해,100 ml의 혈청 학적 병 60 g 지방) (콜라게나 제 900 단위 / 1.5 ml의 DMEM / g 지방)합니다. 부드럽게 용해 후 살균을위한 0.22 μm의 필터를 통해 소화 매체를 전달하는 데 적어도 15 분 동안 진탕 테이블 (100 RPM)에서 소화 매체를 선동. 사용하기 전에 4 ° C에서 보관하십시오. 돼지 2. 해부 피하 지방이 조직 사용하기 전에 37 ° C에 대한 모든 악기, 유리 및 플라스틱 제품 따뜻한 모든 미디어를 소독. 전기 충격적이고 방혈 또는 로컬 IACUC의 규정에 따라 방법을 사용하여 돼지를 희생. 새끼 돼지가 희생 된 후 신중하게 즉시 절개를 수행합니다. 깨끗한 수술 테이블에 돼지를 놓고 (허리와 배를 아래로 향하도록). 중간 선 아래로 양쪽 꼬리와의 목에서 모든 머리를 제거 돼지 뒤쪽에서 머리를 면도. 7.5 %의 povidone-와 돼지의 등쪽 피부를 문질러요오드 세 (새로운 세 독립적-수술)와 시간 후 요오드 약 10 분 동안 피부의 표면 상에 앉을 수. 70 % 에탄올의 여러 스프레이로 포비돈 – 요오드를 제거합니다. 거즈 패드 또는 포비돈 – 요오드 뚜렷한 색이 관찰되지 않을 때까지 반복 한 방향으로 피부를 닦아내 70 % 에탄올을 함유하는 티슈 종이를 사용한다. 지방을 잡고 피부 집게를 사용하는 동안 근육에서 첨부 된 스킨 층과 함께 피하 지방 조직의 돼지 등의 지방 층을 분리 메스를 사용합니다. 즉시 무 혈청 DMEM을 함유하는 멸균 된 비이커 (200 ml)에 연결된 피부와 피하 지방 조직의 지방층 젖어. 층류 세포 배양 후드에서 70 % 에탄올 및 장소 기름 층을 포함하는 비커의 외부 스프레이. 후드의 대형 (40cm X 30cm) 멸균 트리플 레이어 커버 호일을 놓습니다. [A 삼중 층 지속적인 무결성을 보장하기 위해 사용된다.] 놓고피부 커버 호일에 아래로 향하도록 조직. 근육 조직의 오염을 피하기 위해 집게와 가위를 이용하여 지방 조직 오프 나머지 근조직 트림. 사각형 조각으로 지방을 잘라 (~ 7cm X 7cm) 메스 나 가위. 무 혈청 DMEM을 함유하는 새로운 멸균 비이커 (200 mL)에 지방층 이들 정보를 넣는다. 탄소 강철 슬라이서 블레이드 (그림 1) 조립 커버 호일에 사용자 정의 슬라이스 홀더를 설정합니다. 비커에서 지방의 한 조각을 가지고 슬라이서 (상단과 지방 레이어 아래에 피부 층)에 놓습니다. 약 1mm 두께의 조각으로 피하 지방 조직의 지방층을 슬라이스. 가능한 한 가까운 피부의 지방층 슬라이스하지만 피부를 얇게 마십시오. 말하다가 가능한 미세 가위로 지방 조직을 분리합니다. 다진와 250 ㎖의 삼각 플라스크 또는 혈청 학적 병 콜라게나 제를 포함하는 여과 소화 매체를 추가지방 조직 (콜라겐의 54,000 단위 / 90 ml의 DMEM / 60g 지방). 부화 및 콜라게나 제는 조직을 소화 할 수 있도록 37 ℃에서 90 분 동안 진탕 기에서 45 rpm으로 삼각 플라스크를 소용돌이 친다. 참고 : 오버 소화를 방지하기 위해 매 15 ~ 30 분을 확인합니다. 소화 매체가 상당한 조직 덩어리없이 슬러리 경우 소화 과정이 완료된다. 콜라게나 제 소화를 중지 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 DMEM / F12를 함유하는 배지 (소화 매체 같음) 동량을 추가한다. 돼지 등의 피하 지방 조직에서 그림 1. pADSC의 분리에 사용되는 사용자 정의 슬라이서. 해부 지방 조직은 첨부 된 스킨 층과 지방층으로 구성되어있다. 슬라이서는 오버의 회피와 약 1mm 두꺼운 지방층을 슬라이스 필요스킨 층으로 슬라이싱. 슬라이스 홀더, 슬라이서 패드, 탄소 강철 슬라이서 블레이드, 나사 : 왼쪽에서 오른쪽으로. 슬라이서 블레이드 슬라이스 홀더 및 조립 슬라이서 패드 사이에 삽입됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 기질 혈관 분획에서 pADSC 3. 컬렉션 깨끗한 살균 250 mL의 삼각 플라스크에 시폰의 단층 또는 250 ㎖의 혈청 병 통하여 소화 지방 조직을 포함하는 소화 매체를 통과한다. 안내 및 다이제스트의 통과를 돕기 위해 폰의 중간을 우울하게하는 집게를 사용합니다. 배수 및 통과를 완료하기 위해 집게와 쉬폰 트위스트. 네 50 ML 원뿔 원심 분리기 튜브 (~ 튜브 당 40 ml의 매체)로 소화 매체를 배포합니다. 10 분 동안 700 XG에 원심 분리기 기질 혈관 세포의 펠렛을 수집합니다. <li> 성숙한 지방 세포를 포함하는 지방 상부 층의 대부분을 제거하는 펠렛을 방해하지 않고 상등액을 경사 분리한다. 피펫 튜브 부드러운 흔들림으로 펠렛을 재현 탁 각 튜브에 10 ㎖의 DMEM을 첨가하여 침전물을 세척 하였다. 6 분 동안 700 XG에 원심 분리기. 뜨는을 가만히 따르다. 10 ml의 ACK 용해 버퍼를 추가 한 후 피펫으로 펠렛을 재현 탁. 그것은 기질 혈관 부분에 붉은 혈액 세포를 용균하는 RT에서 7 분 (5 분 ~ 10)에 대해 서 보자. 튜브의 부드러운 흔들림으로 반응을 정지 한 후 10 분 동안 700 × g으로 원심 분리에 DMEM (10 ㎖)의 동일한 양을 추가한다. 각 튜브에 10 ML의 DMEM을 추가, 뜨는을 가만히 따르다 6 분 동안 700 XG에서 반복 피펫으로 펠렛, 원심 분리기를 재현 탁. 두 번 반복합니다. 수집하고 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 스트레이너를 통해 정지 세포와 DMEM (60g의 지방을 대표하는 4 관에서 40 ML의 DMEM의 총)을 전달합니다. 조심스럽게 피펫 메디칼음 여러 번 새로운 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 잘 나누어지는 0.4 % 트리 판 블루 용액 (1시 10분 희석) 180 μL와 혼합 세포 함유 매체의 20 μl를 혼합합니다. DMEM / F12, 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 1 %의 항생제를 함유하는 배지와 배양 접시 나 플레이트의 원하는 크기에 60,000 세포 / ㎠의 밀도에서 후 혈구 종자 pADSC와 셀 개수 -streptomycin-암포 테리 신 B 용액 (P / S / A). 일반적으로, 지방 세포 또는 골 세포 분화 용 6- 웰 조직 배양 플레이트에 pADSC 시드. 줄기 세포 나 연골 세포 분화의 표면 마커 염색에 대한 10 cm 요리에 p​​ADSC을 시드. 접시에 세포 부착을 허용, 5 % CO 2 공기에서 37 ° C 배양기에서 접시 나 요리를 품어. 유동 세포 계측법에 의해 pADSC 4. 식별 줄기 세포 표면 마커 24 시간 후, 배지를 완전히 제거 회 씻어인산 완충 용액 (PBS), 37 ° C에서 5 분 동안 0.25 % 트립신 EDTA 1 ㎖ 수확 세포 회 전자 10 cm 접시. , 배지 (1 ml)을 같은 양으로 트립신 EDTA를 중화 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 수집 한 후 7 분 동안 400 × g에서 원심 분리기. 뜨는을 가만히 따르다. 7 분 동안 400 XG에서 원심 분리와 결합 피펫으로 두 번 3 ㎖ 얼음처럼 차가운 FCS-세척 버퍼에 사용하여 재 서스펜션 (PBS 10 % FBS를 포함) 펠렛을 씻으십시오. 재현 탁은 수 및 FCS 빙냉 세척 완충액에 10 6 세포 / ml로 pADSC을 조정한다. 여러 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 장소 세포 (100 μL / 각각의 튜브) 및 하나 피코 에리 트린 – 복합 CD4a (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE에 대한 항체와 30 분 동안 4 ° C에서 pADSC를 포함하는 튜브를 품어 , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE 또는 직접 염색 MHC II-PE. FCS-세척 완충액 400 × g에서의 centrifugat과 함께 10 ㎖로 두 번 세포를 세척하여 반응을 정지7 분 동안 이온. 수정 및 제조업체의 지침 및 이전 간행물 (18)에 따라 유동 세포 계측법에 대해 (0.01 %의 FBS와 1 %의 포름 알데히드 PBS)를 고정 버퍼에 세포를 재현 탁. 지방 세포, 골 세포와 연골 세포로 pADSC 5. 차별화 지방 세포에 pADSC의 차별화 지방 세포 유도 매체 지방 세포 유지 배지를 준비 (10 ㎎ / ㎖ HEPES 완충액, pH가 8) 1 ml의 인슐린 스톡 최종 진한 = 지방 세포 유도 배지를 들어, 다음을 포함하는 (1 %의 항생제를 P / S가 / A)와 무 혈청 DMEM / F12 1 L를 조제 10 μg의 / ㎖; 1 μL의 T3의 재고 (3,3 ', 5 Triiodo-L-로닌, DMSO의 1 mM)을 최종 진한 = 1 nm의; 200 μL의 트랜스페린 재고 마지막 진한 = 10 μg의 / ㎖ (50 ㎎ / ㎖ 두 번 증류수 H 2 O); 100 ㎕를 덱사메타손 재고 (에탄올 10 mM)을 최종 진한 = 1 μM; 100 μL 로시글리타존 재고 (DMSO 10 mM)을 최종 진한= 1 μM. 유도 배지와 같은 첨가물 지방 세포 유지 배지를 준비하지만, 덱사메타손 생략하고. 지방 세포에 대한 분화 과정 참고 : 6 웰 플레이트에 pADSC를 파종 한 후, pADSC 72 시간 이내에 컨 플루 언트 될 것이다. 3 일 후, 완전히 매체를 제거하고 각 웰에 지방 세포 유도 매체의 3 ㎖를 추가합니다. 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다.이 차별화의 날 제로이다. 3 일 후, 완전히 지방 세포 유도 매체를 제거하고 지방 세포의 유지 보수 매체의 3 ㎖ 3 일마다 교체. 성숙한 지방 세포는 불치병에 약 9 일까지 차별화됩니다. 지방 세포의 90 % 이상이 아니라이 프로토콜을 사용하여 구분됩니다. 이러한 지방 세포는 오일 레드 O 염색에 대한 준비가되어 있습니다. 골 세포로 pADSC의 차별화 골 세포 유도 매체를 준비 : 완전한 문화 mediu을1 μM 덱사메타손, 10 밀리미터-β 글리세로 포스페이트, 50 μg의 / ㎖ 아스코르브 산 -2- 인산 함유 m (10 % FBS와 1 % P / S / A를 가진 DMEM / F12). 골 세포에 대한 분화 과정 참고 : 6 웰 플레이트에 pADSC를 파종 한 후, pADSC 72 시간 이내에 컨 플루 언트 될 것이다. 3 일 후, 완전히 매체를 제거하고 각 웰에 골 세포 유도 매체의 3 ㎖를 추가합니다. 37 ° C 배양기에 플레이트를 돌려줍니다. 이 차별화의 날 제로이다. 3 일마다 골 세포 유도 매체로 교체하십시오. 성숙한 골 세포는 분화 14 일에 의해 형성됩니다. 이 골 세포는 알리자린 레드 S 염색에 대한 준비가되어 있습니다. 연골 세포로 pADSC의 차별화 연골 유도 배지를 준비 : αMEM는 1 % FBS, 6.25 μg의 / ㎖ 인슐린, 50 μg의 / ㎖ 아스코르브 산 -2- 인산을 함유하고, (10) 성장 인자 β1 변환 / ㎖ 겨. 연골 세포에 대한 분화 과정 <ol> 24 시간 동안 10 cm 배양 접시에 pADSC를 파종 한 후, 완전히 배지를 제거하고 PBS로 두 번 설거지. 후 1-5 분 동안 0.25 % 트립신 EDTA의 용액과 함께를 Trypsinize pADSC 1 ml의 배양액으로 중화. 수집, 계산 및 튜브 당 2.5 × 10 5 세포의 밀도로 15 ML 원뿔 튜브에 pADSC을 조정합니다. 세포를 계산하는 혈구를 사용합니다. 7 분 동안 400 × g에서 원심 분리 후, 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 취소하고 15 ML 튜브에 연골 세포 유도 매체의 1ml를 추가합니다. 튜브는 37 ° C 배양기로 돌아갑니다. 이 차별화의 날 제로이다. 바닥에 세포를 제거하지 않고 연골 세포 유도 매체를 3 일마다 교체합니다. 성숙한 연골 세포는 약 14 일 형성 할 것이다. 이 연골 세포는 톨루이딘 블루 O 염색에 대한 준비가되어 있습니다. 차별화 된 지방 세포, Osteocy 6. 염색TES와 연골 세포 차별화 된 지방 세포 오일 레드 O 염색 일 9시​​, 분화 된 지방 세포를 6 웰 배양 플레이트에서 지방 세포 유지 배지를 제거하고 PBS로 두 번 플레이트를 세척한다. [다음 단계에서, 6 웰 플레이트의 각 웰을 덮도록 충분한 지정된 시약을 추가한다.] 적어도 10 분 동안 10 % 포르말린 용액으로 지방 세포를 고정한다. 10 % 포르말린 용액을 제거하고 두 번 증류수로 두 번 접시를 씻으십시오. 두 세척 한 후, 배양 접시에 100 % 프로필렌 글리콜을 추가 1 분 동안 방치하자. 100 % 프로필렌 글리콜을 분리 한 다음 배양 용기에 오일 레드 O 용액 (프로필렌 글리콜 0.5 %)를 추가합니다. 부드러운 교반 (100 RPM)와 로커 통에 적어도 10 분 동안 서 보자. 기름 빨간 O 솔루션을 제거한 다음 60 % 프로필렌 글리콜로 교체합니다. 1 분 동안 서 보자. 60 %의 프로필렌 글리콜을 제거한 후 D로 두 번 접시를 씻어물을 ouble는 증류. 10 % 포르말린 용액으로 교체합니다. 지방 세포의 내부의 스테인드 지질 방울은 광학 현미경으로 관찰을위한 준비가되어 있습니다. 세포 내 오일 레드 O의 정량 (아래 선택적 단계) : 현미경 관찰 한 후, 10 %를 포르말린 용액을 제거하고 두 번 증류수로 두 번 접시를 씻으십시오. 완전히 판을 배출하고 6 웰 플레이트에 이소프로판올 500 μl를 추가합니다. 이소프로판올 오일 레드 O.의 염료를 용해 적어도 10 분 동안 부드러운 로커 통 (100 RPM)에서 6 웰 플레이트에 서 보자 오일 레드 O를 함유하는 이소프로판올을 흡인하고 96 웰 플레이트 상에 배포한다. 510 nm에서 분광 광도계 판독을 사용하여 상기 추출 된 오일 레드 O 정량화. 차별화 된 골 세포에 대한 알리자린 레드 S 염색 14 일에서 차별화 된 골 세포와 6 웰 플레이트에서 골 세포 유도 매체를 제거하고 PBS로 두 번 접시를 씻으십시오. [followi에서NG는 6- 웰 플레이트의 각 웰을 덮도록 충분한 지정된 시약을 추가하는 단계.] 적어도 10 분 동안 10 % 포르말린 용액에 골 세포를 고정한다. 각 웰에서 10 % 포르말린 용액을 제거하고 두 번 증류수로 두 번 접시를 씻으십시오. 이 세척 한 후, 6 웰 플레이트에 2 % 알리자린 레드 S 용액 (= 4.1-4.3의 pH)를 추가하고 부드러운 로커 통 (100 RPM)에 적어도 15 분 동안 서 보자. 알리자린 레드 S 솔루션을 제거하고 두 번 증류수로 두 번 접시를 씻으십시오. 10 % 포르말린 용액으로 교체합니다. 골 세포는 광학 현미경으로 관찰을위한 준비가되어 있습니다. 차별화 된 연골 세포에 대한 톨루이딘 블루 O 염색 14 일에, PBS로 두 번 상기 튜브를 상기 튜브의 하단에 분화 된 연골 세포의 침전물을 제거하고 세척없이 15ml의 원뿔형 튜브로부터 대기음 연골 유도 배지. [다음 단계에서, 코브만큼 지정 시약을 추가r은 튜브 또는 섹션 슬라이드 하단에 연골 세포.] 적어도 10 분 동안 10 % 포르말린 용액에 연골 세포를 고정한다. 각 관에서 10 % 포르말린 용액을 제거하고 두 번 증류수로 두 번 튜브를 세척한다. 이 세척 한 후, 5 ㎛의 두께로 저온 유지 장치와의 OCT 화합물 및 섹션의 알약을 포함. 톨루이딘 블루 O 용액 (pH가 4.1으로, 0.1 %)로 저온 유지 부의 슬라이드 얼룩. 톨루이딘 블루 O 솔루션을 제거하고 두 번 증류수로 두 번 절을 씻는다. 참고 : 슬라이드에 연골 세포를 광학 현미경으로 관찰을위한 준비가되어 있습니다.