ブタ皮下脂肪組織から分離し、脂肪由来幹細胞の分化

注：この方法は確立され、研究に使用される以前にこの研究室14から17 を報告されています。時間をかけて方法論を修正しました。現在の手順は、6ウェル組織培養プレートに播種すると、ワン子ブタ（7~9日齢）からブタ皮下脂肪組織60gの平均を使用して行きました。特に指定しない限り、全ての手順を室温で実施しました。全ての動物実験は、国立台湾大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。 1.消化培地を調製首の後ろからの皮下脂肪組織を得ます。ブタの大きさに応じて（7~9日齢）子豚あたり40〜80グラム、。ここでは、1匹のブタから​​得られた皮下脂肪組織の60グラムを使用します。 消化培地を準備：54,000単位の合計でコラゲナーゼII粉末を計量し、90でそれを溶解mlのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、100ミリリットル血清学的ボトルコラゲナーゼ/ 1.5ミリリットルDMEM /グラムの脂肪の（900単位）で60グラムの脂肪）のために。 静かに溶解した後、滅菌のために0.22μmのフィルターを通して消化培地を渡すために、少なくとも15分間振盪台（100回転）上の消化培地を攪拌。使用前に4℃で保管してください。 ブタから2.解剖皮下脂肪組織使用前に37℃にすべての機器、ガラスやプラスチックの構造と暖かいすべてのメディアを滅菌します。 電気素晴らしいと失血またはローカルIACUCの規則に従った方法を使用して子豚を生け贄に捧げます。子豚を屠殺した後、慎重に、すぐに解剖を行います。 きれいな手術台上の子豚を置き（背中や腹を上下に向いています）。正中線まで首から尾までと両側のすべての毛を取り除く子豚から髪をバック剃り落とします。 7.5％と豚の背側の皮膚をスクラブpovidone-ヨウ素3回（3新しい独立-スクラブ付き）、次いでヨウ素は約10分間、皮膚の表面の上に座ることができます。 70％エタノールの複数のスプレーとポビドンヨードを削除します。ポビドンヨードの明らかな色が観察されなくなるまで繰り返し、1方向に皮膚を拭くために70％エタノールを含むガーゼパッドまたはティッシュペーパーを使用してください。 鉗子を使用して脂肪と皮膚を保持しながら、筋肉の付着したスキン層と一緒に皮下脂肪組織のブタの背脂肪層を分離するためにメスを使用してください。 すぐに無血清DMEMを含有する滅菌ビーカー（200ml）中に付着した皮膚と皮下脂肪組織の脂肪層を浸します。 層流細胞培養フード中で70％エタノールと場所で脂肪層を含むビーカーの外側をスプレー。フードの大きい（40センチメートル×30 cm）の滅菌三重層のカバー箔を置きます。 【三重層は、継続的な整合性を確保するために使用されています。] 置きカバー箔上に下向きに皮膚と組織。 筋肉組織による汚染を避けるために、鉗子およびハサミを使用して脂肪組織から残りの筋肉組織をトリミング。 メスやはさみで正方形のピース（〜7センチメートルX 7センチ）の中に脂肪をカット。無血清DMEMを含む新しい滅菌ビーカー（200ミリリットル）に脂肪層のこれらの部分を入れてください。 炭素鋼スライサーの刃（ 図1）を用いて組み立てカバー箔上にカスタマイズされたスライスホルダーを設定します。ビーカーのうち、脂肪の1枚を取り、スライサー（トップと脂肪層の下の皮膚層）の上に置きます。 厚さ約1mmの小片に皮下脂肪組織の脂肪層をスライス。できるだけ近い皮膚から脂肪層をスライスが、皮膚をスライス避けます。 ミンスはできるだけ細かいハサミで脂肪組織をスライスしました。 みじん切りに250ミリリットルの三角フラスコや血清学的ボトルにコラゲナーゼを含むフィルタリング消化培地を追加します。脂肪組織（コラゲナーゼの54,000単位/ 90ミリリットルDMEM / 60グラムの脂肪）。 インキュベートし、コラゲナーゼは、組織を消化できるようにするために37℃で90分間、オービタルシェーカーで45 rpmで三角フラスコを旋回させます。 注：オーバー消化避けるために、すべての15〜30分を確認してください。消化培地は、有意な組織塊なしのスラリーである場合、消化プロセスを終了します。 コラゲナーゼ消化を停止し、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM / F12を含む培地の（消化培地に等しい）等量加えます。 ブタの背部皮下脂肪組織から図1 pADSCの単離のために使用されるカスタマイズされたスライサー。解剖脂肪組織は、添付のスキン層と脂肪層で構成されています。スライサーは、オーバーの回避で約1ミリメートルの厚さの脂肪層をスライスすることが要求されます皮膚層にスライスします。スライスホルダー、スライサパッド、炭素鋼スライサーブレード、ネジ：左から右へ。スライサーの刃がスライスホルダーと組み立てスライサーパッドとの間に挿入されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 間質血管画分からpADSCの3コレクションきれいな滅菌250ミリリットルの三角フラスコまたは250ミリリットル血清学的ボトルにシフォンの単層を介して消化脂肪組織を含む消化培地を渡します。案内し、ダイジェストの通過を助けるためのシフォンの中央を押下する鉗子を使用してください。 ドレン通路を完了するために鉗子でシフォンをねじります。 4 50mlコニカル遠心管（チューブあたり〜40ミリリットル培地）に消化培地を配布します。 間質血管細胞のペレットを収集するために10分間、700×gで遠心分離します。 <li>成熟脂肪細胞を含むトップ脂肪層の大部分を除去し、ペレットを乱すことなく上清を除去。ピペッティングとチューブを穏やかに振とうしながら、ペレットを再懸濁し、各チューブに10ミリリットルのDMEMを添加することにより、ペレットを洗浄。 6分間700×gで遠心分離します。上清を除去。 10ミリリットルACK溶解緩衝液を追加し、ピペッティングによりペレットを再懸濁。それは間質 – 血管画分中の赤血球を溶解し、室温で7分（5〜10分）放置してみましょう。 チューブを穏やかに振とうしながら反応を停止した後、10分間700×gで遠心分離するDMEM（10ミリリットル）の等量を追加します。 上清を除去、各チューブに10ミリリットルのDMEMを追加し、6分間700×gで繰り返しピペッティングし、遠心分離でペレットを再懸濁。二回繰り返します。 収集し、新しい50mlコニカルチューブに100μmのストレーナを介して懸濁した細胞を含むDMEM（60グラムの脂肪を表す4管からの40ミリリットルのDMEMの合計）を渡します。 静かにピペットメディええと、いくつかの回を新しい1.5mlエッペンドルフチュー​​ブによく、アリコート0.4％トリパンブルー溶液（1:10希釈）180μlのと混合し、細胞含有培地を20μlを混合します。 DMEM / F12、10％ウシ胎児血清（FBS）及びペニシリン、1％抗生物質を含む培地で培養皿またはプレートの所望の大きさに60,000細胞/ cm 2の密度で、次いで血球計数器とシードpADSCで細胞を数えます-streptomycin-アムホテリシンB溶液（P / S / A）。一般に、脂肪細胞または骨細胞分化のために6ウェル組織培養プレートにpADSCをシード。幹細胞又は軟骨細胞分化の表面マーカーの染色のための10cm皿上に播種pADSC。 プレートへの細胞接着を可能にするために、5％CO 2で、空気中で37℃のインキュベーターでプレートや皿をインキュベートします。 フローサイトメトリーによるpADSC 4.同定幹細胞表面マーカー 24時間後、培地を完全に削除し、目の洗浄37℃で5分間、0.25％トリプシン-EDTA 1 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、および収穫細胞と二回E 10 cmのディッシュ。 、培地（1ミリリットル）の等量でトリプシン-EDTAを中和する新しい15 mlのコニカルチューブに細胞を回収し、その後7分間400×gで遠心します。 上清を除去。 7分間400×gの遠心分離に結合されたピペッティングにより再懸濁を使用して（PBS、10％FBSを含む）3ミリリットルの氷冷FCS-洗浄緩衝液中で2回ペレットを洗浄。 再懸 ​​濁は、カウントし、氷冷FCS洗浄緩衝液中に10 6細胞/ mlにpADSCを調整します。場所細胞（100μL/各チューブ）は、複数の新しい15 mlのコニカルチューブにし、フィコエリトリン結合CD4a（CD4a-PE）のいずれかに対する抗体で4℃で30分間pADSCを含むチューブをインキュベート、CD29-PE、CD31-PE 、CD44-PE、CD45-PE、CD90-PE、MHC I-PEまたは直接染色のためにMHC II-PE。 FCS-洗浄バッファーは、400×gでのcentrifugatに結合された10ミリリットルで細胞を2回洗浄することにより反応を停止させます7分間のイオン。 メーカーの指示と私たちの以前の出版物18に従ってフローサイトメトリー用の固定バッファ（0.01％FBSおよび1％のホルムアルデヒドを含むPBS）で細胞を固定し、再懸濁します。 脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞へのpADSCの5分化脂肪細胞への分化pADSC 脂肪細胞誘導培地と脂肪細胞維持培地を準備脂肪細胞誘導培地については、以下を含む（1％P / S / Aの抗生物質での）無血清DMEM / F12の1 Lの準備：1ミリリットルのインスリンストック（10 mg / mlでHEPES緩衝液、pH 8）、最終濃度を= 10 / mlの。 1μlのT3株（3,3 '、5トリヨードL-チロニン、DMSO中の1mM）、最終濃度= 1 nMの。 200μlのトランスフェリンストック最終濃度= 10 / mlの（50 mg / mlで再蒸留H 2 O）; 100μlのデキサメタゾンストック（エタノール中10mM）、最終濃度= 1μM; 100μlのロシグリタゾンストック（DMSO中10mM）、最終濃度= 1μM。 誘導培地と同じ添加物と脂肪細胞維持培地を準備したが、デキサメタゾンを省略しています。 脂肪細胞のための分化過程注：6ウェルプレート上pADSCを播種した後、pADSCは72時間以内にコンフルエントされます。 3日後、培地を完全に除去し、各ウェルに脂肪細胞誘導培地の3ミリリットルを追加します。インキュベーターにプレートを返します。 これは、分化の日はゼロです。 3日後、完全に脂肪細胞誘導培地を除去し、脂肪細胞維持培地の3ミリリットル、3日毎に交換してください。成熟脂肪細胞は、末端約9日によって区別されます。脂肪細胞の90％以上がよく、このプロトコルを使用して区別されます。これらの脂肪細胞は、オイルレッドO染色のための準備が整いました。 骨細胞への分化pADSC 骨細胞誘導培地を準備します。完全培養mediu1μMのデキサメタゾン、10mMのβグリセロリン酸および50μg/ mlのアスコルビン酸-2-リン酸を含有するM（10％FBSおよび1％P / S / Aを含むDMEM / F12）。 骨細胞のための分化過程注：6ウェルプレート上pADSCを播種した後、pADSCは72時間以内にコンフルエントされます。 3日後、完全培地を除去し、各ウェルに骨細胞誘導培地の3ミリリットルを追加します。 37℃のインキュベーターにプレートを返します。これは、分化の日はゼロです。 3日ごとに骨細胞誘導培地と交換してください。成熟した骨細胞は、分化の14日までに形成することになります。これらの骨は、アリザリンレッドS染色のための準備が整いました。 軟骨細胞への分化pADSC 軟骨細胞誘導培地を調製する：αMEM1％FBS、6.25 / mlのインスリン、50μg/ mlのアスコルビン酸-2-リン酸を含有し、10成長因子β1を形質転換をng / ml。 軟骨細胞のための分化過程<ol> 24時間、10 cmの培養皿上pADSCを播種した後、完全培地を除去し、PBSで2回皿を洗います。 その後トリプシン処理0.25％トリプシン-EDTAで5分間、1 mlのpADSC、1mlの培養培地で中和します。収集、カウントとチューブあたり2.5×10 5細胞の密度で15ミリリットルコニカルチューブにpADSCを調整します。細胞をカウントし、血球計数器を使用してください。 7分間400×gで遠心分離した後、ペレットを乱すことなく、上清を廃棄し、15mlチューブに軟骨細胞誘導培地の1ミリリットルを追加します。チューブを37℃のインキュベーターに戻されます。これは、分化の日はゼロです。 底に細胞を除去することなく、3日ごとに軟骨細胞誘導培地を交換してください。成熟した軟骨細胞は、約14日間で形成することになります。これらの軟骨細胞はトルイジンブルーO染色のための準備が整いました。 差別脂肪細胞、Osteocy 6.染色TESおよび軟骨細胞分化した脂肪細胞のためのオイルレッドO染色 9日目に、分化した脂肪細胞で6ウェル培養プレート中で脂肪細胞維持培地を除去し、その後、PBSで2回プレートを洗浄します。 【以下の手順で、6ウェルプレートの各ウェルをカバーするために十分な指定された試薬を加えます。] 少なくとも10分間、10％ホルマリン溶液で脂肪細胞を修正しました。 10％ホルマリン溶液を除去し、二重蒸留水で2回プレートを洗浄します。 2回洗浄した後、培養プレートに100％のプロピレングリコールを添加し、1分間放置しました。 100％のプロピレングリコールを外し、培養プレートにオイルレッドO溶液（プロピレングリコール中0.5％）を追加します。穏やかに撹拌（100 rpm）してロッカーシェーカー上で、少なくとも10分間放置してみましょう。 オイルレッドO溶液を除去した後、60％のプロピレングリコールと交換してください。 1分間放置してみましょう。 60％のプロピレングリコールを外し、dでプレートを2回洗浄ouble蒸留水。 10％ホルマリン溶液に交換してください。脂肪細胞の内部染色脂肪滴は、光学顕微鏡による観察の準備ができています。 細胞内のオイルレッドO（下記オプションの手順）の定量：顕微鏡で観察した後、10％ホルマリン溶液を除去し、二重蒸留水で2回プレートを洗浄します。 完全版を排出し、6ウェルプレートにイソプロパノール500μlのを追加します。 イソプロパノールは、オイルレッドOの染料を溶解させるために、少なくとも10分間、穏やかなロッカーシェーカー（100 rpm）での6ウェルプレートに立ってみましょうオイルレッドOを含むイソプロパノールを吸引し、96ウェルプレートに分配します。 510 nmで分光光度読み取りを使用して抽出オイルレッドOを定量化します。 分化した骨細胞のためのアリザリンレッドS染色 14日目に、分化した骨細胞で6ウェルプレートから骨細胞誘導培地を除去し、PBSで2回プレートを洗浄します。 [followiでステップngを、6ウェルプレートの各ウェルをカバーするのに十分な指定された試薬を加えます。] 少なくとも10分間、10％ホルマリン溶液中で骨細胞を修正しました。 各ウェルから10％ホルマリン溶液を除去し、二重蒸留水で2回プレートを洗浄します。 2回洗浄した後、6ウェルプレートに2％アリザリンレッドS液（pH = 4.1〜4.3）を追加し、穏やかなロッカーシェーカー（100 rpm）での少なくとも15分間放置しました。 アリザリンレッドS溶液を除去した後、二重蒸留水で2回プレートを洗浄します。 10％ホルマリン溶液に交換してください。骨細胞は、光学顕微鏡による観察の準備ができています。 分化した軟骨細胞のためのトルイジンブルーO染色 14日目、2回PBSでチューブをチューブの底に分化した軟骨細胞の堆積物を除去し、洗浄せずに15ミリリットルコニカルチューブから吸引軟骨細胞誘導培地。 [次の手順では、入り江に十分な指定された試薬を追加チューブの底にまたはセクションのスライド上の軟骨細胞rを。] 少なくとも10分間、10％ホルマリン溶液中の軟骨細胞を修正しました。 各チューブから10％ホルマリン溶液を除去し、二重蒸留水で2回チューブを洗浄します。 2回洗浄した後、5ミクロンの厚さでクライオスタットと10月の化合物とセクションのペレットを埋め込みます。 トルイジンブルーO溶液（pHは4.1と0.1％）で凍結切片のスライドを染色します。 トルイジンブルーO溶液を除去した後、二重蒸留水で2回セクションを洗います。 注意：スライド上の軟骨細胞は、光学顕微鏡による観察の準備ができています。