Isolement et différenciation des cellules souches adipeuses de porcines sous-cutanée des tissus adipeux

Note: Cette méthode a été établie et utilisée dans la recherche indiqué précédemment 14-17 de ce laboratoire; au fil du temps la méthodologie a été modifiée. La procédure en cours a été effectuée en utilisant une moyenne de 60 g de tissu adipeux sous-cutané de porc d'un porcelet (âgés de 7 à 9 jours) avec ensemencement sur des plaques à 6 puits de culture tissulaire. Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante sauf indication contraire. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le Comité des soins et l'utilisation des animaux institutionnels (IACUC) à l'Université nationale de Taiwan. 1. Préparer Digestion Medium Obtenir les tissus adipeux sous-cutané de la nuque et du dos; 40 à 80 g par porcelet (7 à 9 jours old), selon la taille des porcs. Ici, utiliser 60 g de tissus adipeux sous-cutanés obtenus à partir d'un porc. Préparer le milieu de digestion: peser la poudre collagénase II avec un total de 54.000 unités et le dissoudre dans 90 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM,pour 60 g de matières grasses) dans un flacon de 100 ml sérologique (900 unités de collagénase / 1,5 ml de DMEM / g de matière grasse). Agiter doucement le milieu de la digestion sur une table d'agitation (100 rpm) pendant au moins 15 min pour dissoudre et ensuite passer le milieu de digestion à travers un filtre de 0,22 um pour la stérilisation. Conserver à 4 ° C avant utilisation. 2. Disséquer sous-cutanée des tissus adipeux de porcs Stériliser tous les instruments, le verre et articles en plastique et chaud tous les médias à 37 ° C avant utilisation. Sacrifiez le porcelet avec étourdissement électrique et exsanguination ou en utilisant une méthode en conformité avec les réglementations locales IACUC. Effectuer la dissection soigneusement et immédiatement après les porcelets sont sacrifiés. Poser le porcelet sur une table chirurgicale propre (retour vers le haut et le ventre vers le bas). Raser les cheveux de la porcelet arrière enlever tous les cheveux de la nuque à la queue et sur les deux côtés vers le bas de la ligne médiane. Frotter dorsale la peau du cochon avec 7,5% povidoneiode permet trois fois (avec trois nouveaux indépendants-scrubs), puis l'iode pour reposer sur la surface de la peau pendant environ 10 min. Retirez le povidone-iode avec plusieurs sprays de 70% d'éthanol. Utilisez des tampons de gaze ou de papiers tissu contenant 70% d'éthanol pour essuyer la peau dans une direction, en répétant jusqu'à ce qu'aucune couleur évidente de povidone-iode est observée. Utilisation d'un scalpel pour séparer la couche de graisse de porc dorsale du tissu adipeux sous-cutané le long de la couche de peau attachée à partir des muscles tout en maintenant la graisse et la peau à l'aide de pinces. immerger immédiatement la couche de tissus adipeux sous-cutané avec la peau attachée de graisse dans un bêcher stérilisé (200 ml) contenant du DMEM sans sérum. Vaporiser l'extérieur du récipient contenant la couche de graisse à 70% d'éthanol et dans un écoulement laminaire hotte de culture cellulaire. Placer un grand (40 cm x 30 cm) stérilisée triple couche feuille de couverture dans la hotte. [Une triple couche est utilisée pour assurer l'intégrité continue.] Placer letissu avec la peau vers le bas sur la feuille de couverture. Couper le tissu musculaire restant hors du tissu adipeux à l'aide des pinces et des ciseaux pour éviter toute contamination avec le tissu musculaire. Couper la graisse en morceaux carrés (~ 7 cm X 7 cm) avec un scalpel ou des ciseaux. Placer ces morceaux de la couche de graisse dans un nouveau récipient stérilisé (200 ml) contenant du DMEM exempt de sérum. Fixer un support de tranche personnalisé sur la feuille de recouvrement assemblé avec une lame de trancheuse en acier au carbone (figure 1). Prenez un morceau de gras sur le bécher et le placer sur la trancheuse (couche de peau sur le dessus et la graisse couche ci-dessous). Trancher la couche de tissus adipeux sous-cutané de la graisse dans environ 1 mm d'épaisseur de pièces. Trancher la couche de la peau le plus près possible de la graisse, mais éviter de couper la peau. Hacher tranché tissus adipeux avec des ciseaux aussi fins que possible. Ajouter milieu de digestion filtrée contenant de la collagénase à un Erlenmeyer de 250 ml ou une bouteille sérologique avec émincéles tissus adipeux (54.000 unités de collagénase / 90 ml de DMEM / 60 g de matières grasses). Incuber et agiter le flacon d'Erlenmeyer à 45 tours par minute dans un agitateur orbital pendant 90 minutes à 37 ° C pour permettre la collagénase à digérer les tissus. Remarque: Vérifiez toutes les 15 à 30 minutes pour éviter la digestion. Le processus de digestion est terminée si le milieu de digestion est une suspension sans amas de tissus importants. Ajouter un volume égal (égaux au milieu de digestion) du milieu de culture contenant du DMEM / F12 avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) pour arrêter la digestion par la collagénase. Figure 1. Un trancheur adapté utilisé pour l' isolement de pADSC. Disséqué les tissus adipeux provenant de tissus adipeux sous – cutanés dorsaux de porc sont composées de la couche de graisse avec des couches jointes de la peau. Une trancheuse est nécessaire pour couper la couche d'environ 1 mm d'épaisseur avec l'évitement de surmonter de graissedécouper dans les couches cutanées. De gauche à droite: support de tranche, pad trancheuse, lame de trancheuse en acier au carbone, et les vis. Lame de Slicer est inséré entre le support de tranche et le tampon de trancheuse lorsqu'il est assemblé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 3. Collecte de pADSC de la fraction stroma-vasculaires Passez le milieu de digestion contenant les tissus adipeux digérés par une seule couche de mousseline dans un stérilisée Erlenmeyer de 250 ml propre ou une bouteille de 250 ml sérologique. Utilisez une pince pour enfoncer le milieu de la mousseline pour guider et aider le passage de la digestion. Égoutter et tordre le chiffon avec une pince pour terminer le passage. Distribuer le milieu de digestion en quatre 50 ml coniques des tubes de centrifugeuse (~ moyennes de 40 ml par tube). Centrifuger à 700 g pendant 10 minutes pour recueillir le culot de cellules stromales-vasculaires. <li> Décanter le surnageant sans déranger les pastilles pour éliminer la majeure partie de la couche supérieure de matière grasse contenant des adipocytes matures. Laver le culot par addition de 10 ml de DMEM dans chaque tube pour remettre en suspension le culot avec pipetage et agitation douce du tube. Centrifuger à 700 g pendant 6 min. Décanter le surnageant. Ajouter 10 ml de tampon de lyse ACK puis resuspendre le culot par pipetage. Laisser reposer pendant 7 minutes (5 à 10 min) à température ambiante pour lyser les globules rouges dans la fraction stroma-vasculaire. Ajouter des quantités égales de DMEM (10 ml) pour arrêter la réaction en agitant doucement du tube et puis centrifuger à 700 g pendant 10 min. Décanter le surnageant, on ajoute 10 ml de DMEM dans chaque tube, la remise en suspension du culot avec pipetage répété, et centrifuger à 700 g pendant 6 min. Répéter deux fois. Recueillir et passer le DMEM (total de 40 ml de DMEM à partir de 4 tubes représentant 60 g de gras) avec des cellules en suspension à travers un tamis de 100 um dans un nouveau 50 ml tube conique. Doucement pipette medium à plusieurs reprises pour bien et aliquote mélanger 20 pi de milieu contenant des cellules mélangées avec 180 pi de solution de bleu de trypan 0,4% (dilution 1:10) dans un nouveau 1,5 ml Eppendorf tube. Compter les cellules avec un pADSC de semences hémocytomètre puis à une densité de 60.000 cellules / cm2 sur une taille désirée de boîte de culture ou d'une plaque avec un milieu de culture contenant DMEM / F12, 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% d' antibiotiques de pénicilline solution B -streptomycin-amphotéricine (P / S / A). Généralement, ensemencer le pADSC sur les 6 puits des plaques de culture de tissus pour adipocyte ou la différenciation des ostéocytes. Graine du pADSC sur des plats de 10 cm pour le marqueur de surface coloration des cellules souches ou la différenciation des chondrocytes. Incuber les plaques ou les plats de la couveuse 37 ° C dans l' air avec 5% de CO 2 pour permettre la fixation des cellules sur les plaques. 4. Identification des marqueurs de cellules souches Surface de pADSC par cytométrie de flux Après 24 heures, retirer le support complètement, laver ee 10 cm plat à deux reprises avec un tampon phosphate salin (PBS) et des cellules de récolte avec 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA pendant 5 min à 37 ° C. Neutraliser trypsine-EDTA avec des quantités égales de milieu de culture (1 ml), de recueillir les cellules dans un nouveau tube conique de 15 ml, puis centrifuger à 400 x g pendant 7 min. Décanter le surnageant. Laver le culot deux fois dans 3 ml de tampon de FCS lavage glacé (PBS contenant du FBS à 10%) en utilisant la remise en suspension par pipetage couplée à une centrifugation à 400 g pendant 7 min. Resuspendre, compter, et ajuster pADSC 10 6 cellules / ml dans un tampon FCS-lavage glacé. les cellules place (100 ul / chaque tube) dans de nouveaux tubes coniques de 15 ml multiples et incuber les tubes contenant pADSC à 4 ° C pendant 30 minutes avec des anticorps dirigés contre l'une ou l'autre CD4a conjugués à la phycoérythrine (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE ou MHC II-PE pour la coloration directe. Arrêter la réaction par lavage des cellules deux fois dans 10 ml de tampon FCS-lavage couplé avec 400 × g centrifugation pendant 7 min. Fixer et resuspendre les cellules dans un tampon de fixation (PBS avec 0,01% de FBS et 1% de formaldéhyde) pour cytométrie en flux selon les instructions du fabricant et de notre publication précédente 18. 5. Différenciation des pADSC en adipocytes, Ostéocytes et chondrocytes Différenciation des pADSC en adipocytes Préparer adipocyte milieu d'induction et de milieu d'entretien adipocytaire Pour un milieu d'induction de l'adipocyte, préparer 1 L de sans sérum DMEM / F12 (avec des antibiotiques de 1% P / S / A) contenant les éléments suivants: 1 ml d'insuline stock (10 mg / ml de tampon HEPES, pH 8), conc = 10 pg / ml; 1 pi T3 stock (3,3 ', 5-Triiodo-L-thyronine, 1 mM dans du DMSO), conc = 1 nM; 200 pl transferrine stock (50 mg / ml à double H 2 O distillée), conc = 10 pg / ml; 100 dexaméthasone pi stock (10 mM dans de l'éthanol), conc = 1 uM; 100 rosiglitazone pi stock (10 mM dans du DMSO), conc= 1 pm. Préparer un milieu d'entretien des adipocytes avec les mêmes additifs que le milieu d'induction, mais avec omission de la dexaméthasone. processus de différenciation des adipocytes Remarque: après l'ensemencement pADSC sur des plaques à 6 puits, pADSC sera confluentes dans les 72 heures. Après 3 jours, retirez le support complètement, puis ajouter 3 ml de milieu adipocyte d'induction dans chaque puits. Remettre les plaques dans l'incubateur. Ceci est le jour zéro de la différenciation. Après 3 jours, retirez le support adipocyte d'induction complètement et remplacer par 3 ml de milieu d'entretien adipocytaire tous les trois jours. adipocytes matures seront différenciés en phase terminale par environ 9 jours. Plus de 90% des adipocytes sont bien différenciés en utilisant ce protocole. Ces adipocytes sont prêts pour Oil Red O coloration. Différenciation des pADSC en ostéocytes Préparer le milieu ostéocytes d'induction: toutes mediu de culturem (DMEM / F12 avec 10% de FBS et 1% de P / S / A) contenant 1 uM de dexaméthasone, 10 mM de β-glycérophosphate et 50 pg / ml d'ascorbate-2-phosphate. processus de différenciation des ostéocytes Remarque: après l'ensemencement pADSC sur des plaques à 6 puits, pADSC sera confluentes dans les 72 heures. Après 3 jours, retirez le support complètement et ajouter 3 ml de milieu ostéocytes d'induction dans chaque puits. Remettre les plaques à 37 ° C incubateur. Ceci est le jour zéro de la différenciation. Remplacer avec le milieu ostéocytes d'induction tous les trois jours. ostéocytes matures formeront par 14 jours de différenciation. Ces ostéocytes sont prêts pour Alizarine Red S coloration. Différenciation des pADSC en chondrocytes Préparer un milieu d'induction de chondrocytes: aMEM contenant 1% de FBS, 6,25 pg / ml d'insuline, 50 ng / ml d'ascorbate-2-phosphate, et 10 ng / ml de facteur de croissance transformant β1. processus de différenciation des chondrocytes <ol> Après l'ensemencement pADSC sur des boîtes de culture de 10 cm pour 24 h, éliminer le milieu de culture complètement et laver la vaisselle deux fois avec PBS. Trypsiniser pADSC avec 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA pendant 5 min, puis on neutralise avec 1 ml de milieu de culture. Recueillir, compter et ajuster pADSC dans 15 ml tubes coniques avec une densité de 2,5 x 10 5 cellules par tube. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules. Après centrifugation à 400 x g pendant 7 minutes, jeter le surnageant sans perturber le culot et ajouter 1 ml de milieu chondrocytes d'induction dans un tube de 15 ml. Le tube est retourné à l'incubateur à 37 °. Ceci est le jour zéro de la différenciation. Remplacer le milieu d'induction de chondrocytes tous les trois jours sans enlever les cellules sur le fond. chondrocytes matures se formeront dans environ 14 jours. Ces chondrocytes sont prêts pour le bleu de toluidine O coloration. 6. Coloration de Différenciation adipocytes, Osteocytes et chondrocytes Oil Red O pour la coloration adipocytes différenciés Au jour 9, éliminer le milieu d'entretien des adipocytes dans 6 puits des plaques de culture avec des adipocytes différenciés et puis laver la plaque deux fois avec PBS. [Dans les étapes suivantes, ajouter des réactifs désignés assez pour couvrir chaque puits de la plaque de 6 puits.] Fixer les adipocytes avec une solution de formol à 10% pendant au moins 10 min. Retirer la solution de formol à 10% et laver la plaque deux fois avec de l'eau distillée deux fois. Après deux lavages, ajouter 100% de propylène glycol à la plaque de culture et laisser reposer pendant 1 min. Enlever le propylène-glycol 100%, puis on ajoute une solution d'huile rouge O (0,5% dans du propylène glycol) à la plaque de culture. Laisser reposer pendant au moins 10 min sur un agitateur à bascule avec une légère agitation (100 rpm). Retirer la solution Oil Red O, puis remplacer par 60% de propylène glycol. Laisser reposer pendant 1 min. Retirez le propylène glycol 60%, puis laver la plaque deux fois avec deau ouble-distillée. Remplacer par une solution de formol à 10%. Les gouttelettes lipidiques colorées à l'intérieur des adipocytes sont prêts pour l'observation par microscopie optique. Quantification intracellulaire Oil Red O (des étapes facultatives ci-dessous): après l'observation microscopique, supprimer 10% de solution de formaline et laver la plaque deux fois avec de l'eau distillée deux fois. Égoutter la plaque complètement et ajouter 500 pi d'isopropanol à la plaque de 6 puits. Laissez reposer l'isopropanol dans la plaque de 6 puits sur un agitateur à bascule douce (100 rpm) pendant au moins 10 minutes pour dissoudre le colorant de Oil Red O. Aspirer l'isopropanol contenant Oil Red O et distribuer sur une plaque de 96 puits. Quantifier le Red O L'huile extraite à l'aide d'une lecture spectrophotométrique à 510 nm. Alizarine Red S coloration pour ostéocytes différenciée Au jour 14, éliminer le milieu ostéocytes d'induction à partir de plaques de 6 puits avec ostéocytes différenciés et laver les plaques deux fois avec PBS. [Dans les following étapes, ajouter des réactifs désignés assez pour couvrir chaque puits de la plaque de 6 puits.] Fixer ostéocytes dans une solution de formol à 10% pendant au moins 10 min. Retirer la solution de formol à 10% de chaque puits et laver la plaque deux fois avec de l'eau distillée deux fois. Après deux lavages, ajouter la solution Alizarine Red S 2% (pH = 4,1-4,3) à la plaque de 6 puits et laisser reposer pendant au moins 15 min sur un agitateur à bascule douce (100 rpm). Retirer la solution Alizarine Red S, puis laver la plaque deux fois avec de l'eau distillée deux fois. Remplacer par une solution de formol à 10%. Ostéocytes sont prêts pour l'observation par microscopie optique. Bleu de Toluidine O coloration pour chondrocytes différenciés Au jour 14, Aspirer le milieu des chondrocytes à induction à partir du tube de 15 ml conique sans enlever les sédiments de chondrocytes différenciés dans le fond du tube et on lave le tuyau à deux reprises avec du PBS. [Dans les étapes suivantes, ajouter des réactifs désignés assez pour cover chondrocytes dans la partie inférieure du tube ou sur la lame de coupe.] Fixer les chondrocytes dans une solution de formol à 10% pendant au moins 10 min. Retirer la solution de formol à 10% de chaque tube et laver le tube deux fois avec de l'eau distillée deux fois. Après deux lavages, incorporer des granulés dans le composé octobre et la section d'un cryostat à une épaisseur de 5 um. Colorer la lame des sections de cryostat avec une solution de bleu de toluidine O (0,1% avec un pH de 4,1). Retirer la solution bleu de toluidine O, puis laver la section deux fois avec de l'eau distillée deux fois. Remarque: Les chondrocytes sur des lames sont prêts pour l'observation par microscopie optique.