巨蟹座的建立源于人类传统的骨肉瘤细胞培养

使用本文所述的人体组织的所有实验是经当地伦理委员会（RIF。N.12分之141）。从在AOUC捐赠者获得用于组织样本的收集和样品的使用和储存的知情同意。 1.准备文化通过加入10％胎牛血清（FBS），100IU / ml青霉素和100μg/ ml链霉素的Coon到的改性的Ham的F12培养基制备生长培养基（GM）。过滤，并用0.22微米过滤器消毒通用。通用存储长达1个月在4℃。 通过添加20％FBS，100IU / ml青霉素，100微克/毫升链霉素和3毫克/毫升胶原酶II型到浣熊的改性的Ham的F12培养基制备胶原酶培养基（CM）。过滤，并用0.22微米过滤器消毒的CM。商店的CM长达1个月在-20℃。 通过添加40％FBS的制备用于细胞冷冻（FM）中，100国际单位/毫升青霉素，100微克/毫升链霉素和65.5％二甲基亚砜（DMSO）为浣熊的改良火腿的F12培养基。使用0.22微米的过滤器过滤和消毒FM。 FM存储长达1个月在4℃。 通过添加20％FBS，100IU / ml青霉素和100μg/ ml链霉素的Coon到的改性的Ham的F12培养基制备用于CFU试验（CFUM）培养基。使用0.22微米的过滤器过滤和消毒CFUM。商店CFUM长达1个月在4℃。 毫升Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）不含Ca 2+和Mg 2+无水葡萄糖在1000 – 400毫克胰蛋白酶，200毫克EDTA和1000毫克的D（+）溶解制备胰蛋白酶。 注意：使用0.22微米的过滤器并冷冻在-20℃下进行长达3个月除以新鲜胰蛋白酶-EDTA到50ml等分试样中为25cm 2烧瓶中。储存在4℃下解冻过滤灭菌等份而不丧失活性。 通过加入10％FBS，100IU / ml青霉素，100微克/毫升链霉菌制备的干细胞生长培养基（SCGM）霉素和10ng / ml的bFGF（25微克/毫升股票）到浣熊的改良火腿的F12培养基。在4℃下使用0.22微米的过滤器和储存SCGM最多2周筛选SCGM。 通过在4℃下3天在超纯H 2ö溶解MC制备2％甲基纤维素（MC）。当MC完全溶解，高压灭菌，并在4℃下保存。 注：MC消毒后，就变成固体。为了使MC为液态，储存在4℃。 准备sarcosphere生长培养基（SGM）。通过添加100IU / ml青霉素，100微克/毫升人bFGF（25微克/毫升的库存）制备该培养基新鲜（未使用前2周以上），为20nM孕酮（10μM股票），100μM的腐胺，为30nM亚硒酸钠（30μM的股票），25微克/毫升转铁蛋白（25mg / ml的股票），20微克/毫升胰岛素（20mg / ml的股票），和10ng / mL人表皮生长因子（10微克/毫升的库存）至2X浣熊的改良火腿的F12培养基。过滤，并用0.22微米的FIL消毒SGM之三。存储长达2周，在4℃。 通过加入10％FBS（南美原点），100国际单位/毫升青霉素，100微克/毫升链霉素，10nM的地塞米松（100μM股票），0.2mM的钠L-抗坏血酸-2-磷酸制备成骨培养基（OM）（1 1M贮存），10毫米β甘油（5毫克/毫升股票）和1微克/毫升钙黄绿素（200微克/毫升股票）到浣熊的改良火腿的F12培养基。使用0.22微米的过滤器过滤和消毒OM。保存在4℃。 注：在液氮下存储地塞米松原液保持它们的活性。制备新鲜的OM每2周，以保持以维持介质的分化潜能的地塞米松的活性。 通过将1.66毫克氯化铵制备红细胞裂解缓冲液（ELB），0.2毫克K 2 HPO 4和200毫升0.007毫克EDTA蒸馏水（DH 2 O）。过滤，并用0.22微米过滤器消毒ELB。保存在4°C。 通过加入制备成脂介质（AM）的10％FBS（南美洲原点），100国际单位/毫升青霉素，100微克/ ml链霉素，1μM地塞米松（1mM储备），1μM的牛胰岛素（10mM储备），0.5毫异丁基（IBMX）（500毫米股票），和100μM吲哚美辛（200毫米），浣熊的改良火腿的F12培养基。过滤，并用0.22微米过滤器消毒PM。保存在4℃。 注：在液氮下存储地塞米松原液保持它们的活性。制备新鲜调幅每2周，以保持以维持介质的分化潜能的地塞米松的活性。 制备2％牛血清白蛋白（BSA）在DPBS（BSA / DPBS）。溶解在500毫升DPBS10克BSA和通过在50ml锥形管中aliquotting 50ml料液制备原液。储存于-20℃。 制备4％低聚甲醛（PFA）的在DPBS（PFA / DPBS）中的溶液。在Chemical罩，稀释的多聚甲醛在DPBS和通过在50ml锥形管中aliquotting 50ml料液制备原液。保存在4℃。 2.建立主OS细胞培养和OS有限细胞系（OSA） 注：从在“盟Ortopedia OncologicaêRicostruttiva”，AOUC Careggi酒店，佛罗伦萨收集传统OS活检的新鲜样品制备的主要操作系统细胞培养。所有活检，这是由针穿刺或手术切除肿瘤（ 图1A，B）的一小部分而获得立即置于在补充有100IU / ml青霉素和100μg/ ml链霉素（pH7.4）和培养基运送到他们在那里处理的实验室。所有描述的操作都采用层流罩在无菌条件下进行的。 OS细胞的分离 放置在一活检百毫米培养皿与通用的小体积。用无菌的刺血针和佩里镊子，通过切割其成碎片尽可能小剁碎操作系统组织样品（0.5 – 1毫米）（ 图2A，B）。 覆盖用10ml的CM的酶促消化（ 图2B）的组织片段，并在37℃，5％CO 2培养箱孵育3小时。轻轻取出用吸管片段的悬浮液，并将其转移到15毫升锥形管立即离心（400×g离心5分钟）以沉淀片段。 注：离心后，如果活检富含红细胞，红细胞组成的红色存款可以看出在片段。因此，在进行到机械分散前，治疗与红细胞裂解液的样品。吸弃上清加入5 ml ELB。 暂停沉淀碎片为1分钟，并在400×g离心2离心悬浮液分钟。通过抽吸除去上清液。加入5毫升通用汽车和机械用10毫升血清吸管（开口尺寸，1.5毫米的直径）10分散的碎片 – 的20倍。 离心在400 xg离心悬浮液5分钟。通过抽吸除去上清液，暂停用10毫升GM细胞沉淀，然后将所得的细胞悬浮液转移到100毫米的培养皿。孵育37℃，5％ 二氧化碳培养箱的培养皿中，用新鲜完整的通用汽车每3天更换总经理。 注意：很多时候，通过针穿刺获得的OS组织样品是非常小的，并且包含骨头碎片，这是不通过用胶原酶酶解消化。因此，上清液被移除后，试图通过用移液管糖化粒料片段来分离从骨组织的细胞。 亚文化注：要建立一个OSA，当细胞达到近似汇合，从兵卫删除ř培养容器，稀释，并在一个新的板放置，以使进一步的增长。此传代过程是使用称为胰蛋白酶消化酶过程来实现的。 吸删除网上平台。以解离的细胞单层，加入2 – 3毫升胰蛋白酶在RT（最大18 – 20℃），轻轻摇动一次，并通过抽吸立即除去胰蛋白酶。重复两次。孵育细胞在37℃，3 – 4分钟，直到他们开始分离。 注：良好的胰蛋白酶可以通过有经验的用户如稍不透明的单层形成时，菜举行光小孔看到。这个离解，也可以使用倒置显微镜监测;建议初学者这种方法。 通过加入10ml通用停止胰蛋白酶反应和洗碟以及使用移液管分离的所有细胞。传输1毫升悬浮到了100毫米的培养皿，并添加9毫升GM（1/10分裂的细胞）。 注意： </stro纳克>剩余的细胞悬浮液可以用于细胞扩增（转移到另外100毫米的培养皿），可冻存（见2.3节），或者可在实验的菜肴或增殖测定或其他用途的孔（参见算和镀下面）。 OS原代培养和OSA的冷冻保存 注：多冻结一汇合100毫米培养皿成4-5冷冻管。必须快速进行冷冻保存的过程中，因为-DMSO，其中冷冻过程中保护细胞膜，是有毒的在非冷冻温度下的细胞。 从通过胰蛋白酶消化单层分离细胞培养物（见2.2节），离心沉淀细胞，在400×g离心5分钟，通过抽吸除去上清液，然后迅速中止在调频细胞沉淀。 分装1毫升每小瓶低温这个暂停。立即放置在冷冻箱的填充小瓶用2-丙醇和存储立即直接的夹套tely在-80°CO / N。转印冻存管以液氮为长期贮存次日。 除霜OS细胞系和原代培养物 从液氮储存除霜OS细胞系，解冻冷冻管迅速在37℃下将其放置在实验室水浴中。转移离心管的内容到一个15毫升的锥形管中，加入大约10mL，通用汽车（参见2.3节以去除DMSO）。吸去上清，并暂停在10毫升GM细胞沉淀。板细胞悬液在100毫米培养皿，并在37℃，5％CO 2培养箱孵育。 3. Sarcosphere检测，以隔离OS-的CSCs 注：此实验是在OSA执行。该实验的持续时间是相关的能力的细胞，以形成这些球落（sarcospheres），和时间的范围是7，14，21，和28天。 ESTABsarcosphere测定lishment 准备血细胞计数室和提前全部试剂。 吸移除介质和用胰酶消化单层游离于细胞（参见2.2节）。彻底混合细胞悬液，移液驱散任何团块，并用20微升枪头，收集10微升。 立即转移10μL的细胞悬液至血细胞计数器室边缘，排出悬浮液，并允许它通过毛细管作用盖玻片下绘制。 观察下相衬的血细胞计数室。选择一个10X物镜和聚焦于腔室中的网格线。计数趴在使用这个细分1mm 2中区（也由三个平行线方向）细胞和单网格线作为计数的援助。 测量的浓度，并应用下列公式：1毫升= N * 10 4 / Z（正：细胞在所有的计数的全数字平方1mm 2中; Z：计数正方形1mm 2中）的数量。计算必要到板中的6孔超低附着板分成40,000个细胞每孔240000细胞的总量的细胞悬浮液的体积。 注意：一定要通过电镀细胞转化为一个额外的以及直接制版细胞的正确数目。因此，待镀的细胞的总量为28万细胞。 通过在的25cm 2烧瓶中加入2％的MC（SGM-MC）的50％制备35毫升SGM。准备SGM的考虑5毫升额外的总量，以镀一个额外的好。 添加细胞悬浮液在烧瓶中制备的SGM-MC的计算量，并用移液管以分散任何团块轻轻混匀。板的细胞在6孔超低附着板，并使用倒置显微镜观察被电镀后的细胞的显示方式。 孵育所述细胞在37℃，5％CO 2培养箱。每3天，加上FRbFGF和EGF的向每个孔ESH等份刷新的生长因子的浓度。添加2μL的bFGF和5μL的EGF在每个10纳克/毫升的终浓度，以保持这两个井。 sarcospheres的分离 注：监视sarcosphere测定的良好的进展在7，14，21，和28天，以决定何时需要分离所形成的sarcospheres。 准备在层流罩（ 图3A，B）的所有的试剂和设备。通过将直径为25毫米的净过滤器和一个40微米网眼为膜过滤器保持器组装过滤装置;通过高压（ 图4A-E）消毒。 对于每个孔，用无菌移液管有一个1000微升末端含有sarcospheres培养基转移到注射器用无菌膜过滤器保持器。完全删除含有sarcospheres介质后，洗好由addING5毫升通用，以确保所有的领域转移到注射器中。用显微镜确认所有sarcospheres是否已被追回。如果不是这样，通过重复这一步骤继续进行。 过滤与仅通过重力的膜过滤器保持器的悬浮液无压力，以防止损坏球体，并避免具有sarcospheres通过过滤器横过，从而避免球的损失。轻轻用无菌玻璃巴斯德吸管除去气泡。 注：有时过滤由气泡在膜过滤器保持器的存在阻止。 通过加入10ml通用注射器，让它过滤器没有压力，以确保消除单个细胞清洗过滤装置。从注射器拆开过滤装置，放入培养皿。 使用佩里镊子除去从膜过滤器保持器的净过滤并通过在60毫米与镊子轻轻摇动洗培养皿从膜的纠结释放sarcospheres。然后，将膜在一个井，并且没有更多的球在膜中纠结通过显微镜观察确认。如果球是在膜还在纠结，继续另一次清洗的步骤3.2.4所述。 观察用显微镜释放sarcospheres。孵育释放sarcospheres在37℃，5％CO 2培养箱。重复所有步骤6孔超低附着板的各孔中。 4. OS-CSC线 注：OS-的CSCs从表现通过重新引入和它们在小60毫米的培养皿超低附着条件下镀后不再在单层reculturing这些细胞贴壁扩张sarcospheres获得。 OS-CSC文化 要启用进一步增长，传代细胞，当他们在60达到约90％汇合毫米的培养皿。重复步骤2.2.1建立OS-CSC文化。 停止胰蛋白酶消化通过加入4毫升SCGM和洗碟井，用移液管分离的所有细胞。细胞悬液转移到了100毫米的培养皿，并添加6毫升SCGM。当OS-CSCs的重复部分2.2达到90％融合，传代。 注： 对于体外分析来表征分离的操作系统的CSCs的干细胞样表型，细胞可在不同类型的板被镀。 保留通过冷冻保存建立的OS-CSC线（重复第2.3节中的所有步骤）。通过重复2.4节中的所有步骤解冻冻存OS-肿瘤干细胞。 5. 在体外 nalysis表征OS-CSCs的： 细胞免疫的制备 注：细胞固定在多聚甲醛，当他们在24孔解放军每孔达到汇合权等级德。合流的等级有关试验的类型。 平板OS-肿瘤干细胞在24孔板通过免疫荧光研究表面间充质干细胞（MSC）标记。修复在每口井的细胞，当他们达到50 – 60％汇合。通过抽吸除去SCGM并在DPBS 24孔板洗涤两次。 下化学罩，加入500微升4％PFA / DPBS到每个孔中。孵育在室温10分钟。取出PFA / DPBS，并用超卫生署2 O.洗3倍允许在24孔板在通风柜干燥。 免疫荧光标记的MSC 注：在OS的CSCs的免疫荧光染色固定在4％PFA / DPBS可用于调查使用针对CD44，STRO-1和CD105抗体操作系统的CSCs的MSC样表型。下面的方法是由作者常规使用。 在化学罩，通透已经被固定在4％PFA / DPBS细胞中加入500微升0.2％的Triton X-100 / DPBS到每个孔中。孵育所述细胞在37℃下30分钟。轻轻洗细胞用DPBS 3倍。添加300μL的RNA酶稀释1 / 1,000用2％BSA / DPBS到细胞中，并在37℃下孵育30分钟。 轻轻洗涤细胞用2％BSA / DPBS 3倍。染色细胞的MSC标记。第一抗体仅添加到选择作为各抗体阳性对照的孔中。 添加300μL的抗CD105稀释1/10用2％BSA / DPBS，300微升抗CD44稀释1/10用2％BSA / DPBS，300微升抗的Stro-1 1/10稀释用2％BSA / DPBS和仅200微升2％BSA / DPBS到选择作为各抗体阴性对照的孔中。 孵育在潮湿环境中的细胞在4℃CO / N。洗孔3倍用DPBS，然后两次用2％BSA / DPBS。 通过将特定的二抗揭示初级抗体。 添加300μL的抗兔IgG（驴抗兔IgG [H + L）]稀释1/100用2％BSA / DPBS到每个孔中选择作为CD44和CD105阳性和阴性对照。添加300μL的FITC标记抗小鼠Ig（FITC兔抗小鼠IgG [H + L）]用2％BSA中1/100稀释/ DPBS到每个孔中选择作为阳性和阴性对照为STRO-1。孵育在黑暗中的细胞在室温60分钟。洗井DPBS 6倍。 通过加入300微升鬼笔1/100稀释，用2％BSA的细胞骨架肌动蛋白染色的MSC标记阳性细胞/ DPBS到每个孔中染色的MSC标记免疫荧光。 孵育所述细胞在室温下40分钟。洗井DPBS 3倍，然后用超卫生署2 O.洗两次继续到核的上述免疫荧光染色后的复染。在通风橱中制备碘化溶液10 -5 M在DPBS（股票1.5×10 -3 M）。 添加200μL的碘化丙啶溶液如上所述每个孔着色。孵育细胞S表示2 – 在室温3分钟。用超卫生署2 O.洗孔两次 注：重复部分5.1的所有步骤- 5.2对细胞系HCT8，伯连续分化结肠癌细胞被用作阴性控制线。 成骨分化分析注意：成骨分化持续20天。 板操作系统的CSCs在以1×10 4个细胞/ cm 2在SCCGM的细胞密度24孔板。允许，直到他们达到80细胞在SCGM增长 – 在每一个90％汇合好。 通过改变SCGM到OM启动成骨分化。让细胞在生长OM和刷新中，每3 – 4天。停止成骨分化测定法在10天以评价碱性磷酸酶（ALP）的存在。 修正了4％PFA / DPBS细胞（参见5.1节）。评估通过细胞化学染色成骨细胞表型碱性磷酸酶和HA用茜素红S染色。 ALP细胞化学染色 注：立即开始染色前准备在化学罩染料混合物。 解散40毫克固蓝BB或50毫升的Tris-HCl快速红紫LB盐，pH值9（溶液A）。溶解5毫克萘酚AS-MX磷酸钠盐在1ml DMSO中（溶液B）。加入溶液B完全解决方案A拌匀，获得溶液C.洗涤细胞用DPBS两次。 加入500微升-的溶液1ml℃至每个孔，并在37℃下孵育和5％ 的 CO 2。监测在显微镜下观察细胞染色每10分钟的过程中。 停止染色时ALP阳性细胞变得强烈着色（蓝色与固蓝BB盐或红色固红紫色LB盐），通常30分钟内发生。清洗细胞3倍用超卫生署2 O去除溶液C.的所有残留物如果污渍我的沉淀物S出现，用无水乙醇洗细胞迅速一次。 继续到核中的步骤5.2.5和5.2.5.1中描述的ALP染色后的复染。 茜素红S细胞化学染色 注：在开始实验前准备染料混合物。 准备2％茜素红S（2克茜素红S在100毫升超纯H 2的O）。添加2.5％ 的 NH 3至2％茜素红S以达到pH 6.0。在4℃储存2％茜素红S溶液。用DPBS洗涤细胞一次。 添加茜素红S到细胞中只有几秒钟。 用超卫生署洗井2 O，以控制污染的程度;如果HA存款都没有强烈的有色，重复步骤5.3.5.2。停止染色时的HA沉积物变得强烈红色，这通常在几分钟之内发生。用超卫生署2 O.洗井</li> 成脂分化 注意：试验持续时间取决于在OS-CSC线。该法可以持续14 – 30天。 板操作系统的CSCs在以1×10 4个细胞/ cm 2在SCGM的细胞密度24孔板。允许，直到他们达到80细胞在SCGM增长 – 在每一个90％汇合好。通过改变SCGM到AM发起成脂分化。允许细胞在调幅生长并刷新调幅每周两次。 停止成脂分化检测时脂囊泡是可见的。通过评估油红O染色和苏木精复染原子核的脂肪形成的表型。 苏木复染原子核 注：在开始实验前准备染料混合物。 准备5％的苏木解决方案称为Emallume Carazzi 39。储存在4℃的溶液中。添加Emallume Carazzi仅为2分钟。用洗井ULTrapure卫生署2 O. CFU试验 注：本实验必须以一式三份进行。 板操作系统的CSCs 100 25mm培养皿以450细胞/ cm 2在CFUM的细胞密度。孵育在37℃，5％CO 2培养箱将细胞4周。每周刷新两次CFUM。 染色用甲苯胺蓝的CFU。计数使用倒置显微镜的有色菌落。根据下列公式计算CFU效率：（形成的菌落数/接种细胞数目）×100。 ALDH活性分析 注：ALDH活性已在两个OS-CSC线和在有限成纤维细胞系，将其作为阴性对照使用的ALDH活性比色测定试剂盒进行评价。该试剂盒量化由吸光度读数450nm处的ALDH酶活性。所有的测试都在一式三份被执行。 由胰酶消化分解单层细胞培养（参见2.2节）。在400 xg离心沉淀细胞离心5分钟。按照制造商的协议。 流式细胞分析： 注：单细胞悬浮液需要进行流式细胞术样品最优染色。单细胞悬浮液必须准备为每个要测试的抗体。由胰酶消化分解单层细胞培养（参见2.2节）。 放置细胞悬液在一个锥形管，在分离缓冲液的适当体积执行使用Bürker重悬细胞计数计数室，离心细胞以400 xg离心并以1×10 5个细胞的最终菌体浓度，以获得一个细胞悬浮液/毫升。 离心细胞悬浮液在4℃5分钟。弃上清，洗涤与分离液沉淀。重复此步骤两次。 染色细胞MSÇ标记（ 即 CD44，CD105和STRO-1）40。 在流式细胞仪分析染色阳性细胞悬浮液。 1天之内分析样品标记。在4℃直至分析孵育这些样品。 RT-PCR法 提取和分离RNA 加入1ml裂解试剂到操作系统的CSCs的细胞冷冻包装的样品和吹打沉淀上下数次直接裂解细胞在管中。 离心样品以12,000 xg离心在4℃下1分钟。轻轻地取出上清。将上清转移到新的管中，加入200μL的氯仿，并牢固地盖住管。摇动该管剧烈持续15秒和孵育所述样品在RT 5分钟。 离心样品以12,000 xg离心在4℃下15分钟。该混合物分离成三个不同的阶段。 RNA是只在无色上层水相。 作为PArticularly小心，只取出水相，这相转移到新的管与RNA分离进行。加入500微升异丙醇，以含有水相的管。用手轻轻摇动管。孵育在RT样品10分钟。离心样品以12,000 xg离心在4℃下10分钟。 注：样品离心后，有可能看到的RNA，其形成在侧面和在管底部的凝胶状颗粒。 从管中取出上清液，小心留下底部的RNA的沉淀。 1毫升75％的乙醇添加到管中。涡流管用手几秒钟，然后离心管中，在7500 xg离心在4℃下5分钟。 丢弃乙醇和空气干燥RNA沉淀。吹打溶液上下数次 – （50μL10）当颗粒是干的，重悬在无RNA酶的水RNA沉淀。 确定RNA的由MEAS的产率和纯度uring在260nm用分光光度计280nm处的吸光度。评价标准的1％琼脂糖凝胶的总RNA的完整性。储存在-80℃的RNA。 反向聚合酶链反应 合成使用反转录试剂盒在500纳克RNA样品的第一链cDNA。在冰上解冻RNA样品和解冻包含在RT试剂盒中的必要的解决办法。继续进行，以合成下述制造商的协议的cDNA。 半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术 执行使用1μL的cDNA的各样品中的24微升的最终反应体积模板所有的PCR。使用表1中列出的引物序列为Nanog的10月3/4，SOX2和CD133的基因的扩增。 分离通过1.8％琼脂糖凝胶电泳和染色的RT-PCR产物用溴化乙锭。在紫外光下ILLUM照片萌发的。