Summary

La conversione epigenetico come un metodo semplice e sicuro per ottenere cellule che secernono insulina da adulti fibroblasti cutanei

Published: March 18, 2016
doi:

Summary

Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

Abstract

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a “highly permissive” state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated “epigenetic cell conversion”. It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.

Introduction

Un obiettivo fondamentale della medicina rigenerativa è la generazione di nuove cellule funzionali che possono essere utilizzati per riparare o sostituire danneggiato, degenerata tessuti. Rifare cellule adulte facilmente disponibili in nuovi, convertendoli da un tipo di cellula all'altra, è un approccio particolarmente interessante, soprattutto quando la popolazione di cellule richiesta non è abbondante o di difficile accesso. Tuttavia, le cellule adulte sono molto stabili. Acquisiscono il loro stato differenziato attraverso una restrizione graduale nelle loro opzioni e, una volta raggiunta la specializzazione terminale maturo, hanno stabilmente conservarlo 1.

Negli ultimi anni sono state sviluppate una serie di protocolli, che consentono la riprogrammazione di pluripotenza di una cellula somatica (IPS) ottenuta attraverso l'espressione forzata di una serie di fattori di trascrizione 2,3. In alternativa, la conversione cella può essere ottenuto transdifferenziazione discendenza diretta, introducendo un unico 4 </sup> o una combinazione di fattori di trascrizione 5-7. Questa strategia non comporta il passaggio attraverso uno stato de-differenziati ma richiede elevata espressione della trascrizione specifici fattori 8.

Abbiamo recentemente sviluppato un protocollo di conversione basato sulla breve esposizione di cellule adulte alle proprietà demetilanti della citidina analogico 5-azacitidina (5-aza-CR), un inibitore della DNA metiltransferasi ben caratterizzato. Il passo demetilazione è immediatamente seguito da uno specifico protocollo di differenziazione 9-11 che permette di ottenere il fenotipo morsetto desiderato. Questo metodo è in grado di convertire maturi, cellule differenziate in cellule di diversa stirpe e presenta il notevole vantaggio di evitare sia l'uso di vettori virali e la trasfezione di eventuali fattori di trascrizione esogeni. L'acquisizione di uno stato pluripotente stabile, e il relativo aumento della suscettibilità alle cella instabilità è anche evitato.

<p class="Jove_content"> Il protocollo dettagliato che permette la conversione di adulti fibroblasti cutanei umani in cellule che secernono insulina completamente funzionale qui viene presentato. Tuttavia, è opportuno notare che la tecnica è stata applicata a diversi tipi di cellule ed ha generato risultati positivi, rivolgendosi cellule verso diverse vie di differenziazione. Inoltre, la conversione epigenetica è stato usato con successo nella specie umana e suina 9-13 e nel cane (manoscritto presentato) suggerendo un'ampia efficacia e la robustezza del metodo.

Protocol

Nota: Tutte le procedure descritte di seguito devono essere eseguite sotto cappa a flusso laminare in condizioni sterili. Assicurarsi che tutte le procedure di coltura vengono effettuate sui palchi termostatiche e le cellule vengono mantenute a 37 ° C in tutta la movimentazione. Isolamento dei fibroblasti della pelle 1. Preparare cultura piatto Coating Soluzione Sciogliere 0.1 g di gelatina porcina in 100 ml di acqua (concentrazione finale 0,1%). Sterilizzare soluzione con autoclave. <l…

Representative Results

Istituzione di colture primarie da biopsie cutanee biopsie cutanee sono stati tagliati in piccoli frammenti e messi in gelatina piatti pre-rivestiti. Dopo 6 giorni, fibroblasti cominciato a crescere fuori dei frammenti di tessuto e ha formato un monostrato di cellule (Figura 1A). Le cellule hanno mostrato una tipica forma allungata e, come previsto, visualizzati un'uniforme immuno-positività per fibroblasto specifico vimentina marcatore (Vim, Figura 1…

Discussion

La presente manoscritto descrive un metodo che permette la conversione dei fibroblasti della pelle umana in cellule che producono insulina, attraverso una esposizione transitoria e breve a 5-aza-CR, seguito da uno specifico protocollo di induzione tessuto. Questo approccio consente il passaggio da mesoderma alle cellule legate endoderma, senza l'espressione forzata di fattori di trascrizione o microRNAs né l'acquisizione di uno stato stabile pluripotenti, che rende le cellule più instabile e soggetto a errori …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Carraresi e Fondazione Europea per lo Studio del Diabete (EFSD). GP è supportato da una borsa di studio post-dottorato dell'Università degli Studi di Milano. Gli autori sono membri del COST FA1201 Epiconcept: ambiente epigenetica e Periconception e l'azione COST BM1308 condivisione avanza su grandi modelli animali (SALAAM). TALB è membro del COST CM1406 epigenetica Chemical Biology (EPICHEM).

Materials

Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D5652 PBS; for cell wash and solution preparation
Antibiotic Antimycotic Solution Sigma A5955 Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media
100 mm petri dish Sarstedt 83.3902 For Fibroblast isolation
Porcine Gelatin Sigma G1890 For dish coating
Water Sigma W3500 For solution preparation
35 mm petri dishes Sarstedt 83.39 For Fibroblast isolation
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 41966052 For Fibroblast culture medium
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10500064 FBS; Component of Fibroblast and HP media
L-Glutamine solution Sigma G7513 Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media
Trypsin-EDTA solution Sigma T3924 For Fibroblast dissociation
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS Hycor Biomedical 87144 Cell counting
5-Azacytidine Sigma A2385 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts
Ham's F-10 Nutrient Mix Life Technologies 31550031 For HP medium
DMEM, low glucose, pyruvate Life Technologies 31885023 For HP medium
KnockOut Serum Replacement Life Technologies 10828028 Component of HP medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life Technologies 11140035 Component of HP and Pancreatic Basal media
2-Mercaptoethanol Sigma M7522 Component of HP and Pancreatic Basal media
Guanosine Sigma G6264 Nucleoside mix stock component of HP medium
Adenosine Sigma A4036 Nucleoside mix stock component of HP medium
Cytidine Sigma C4654 Nucleoside mix stock component of HP medium
Uridine Sigma U3003 Nucleoside mix stock component of HP medium
Thymidine Sigma T1895 Nucleoside mix stock component of HP medium
Millex-GS 0,22 µm Millipore SLGS033SB For sterilizing of solution
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Life Technologies PHG0261 bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium
Bovine Serum Albumin Sigma A3311 BSA; Component of Pancreatic Basal medium
DMEM/F-12 Life Technologies 11320074 For Pancreatic Basal medium
B-27 Supplement Minus Vitamin A Life Technologies 12587010 Component of Pancreatic medium
N-2 Supplement Life Technologies 17502048 Component of Pancreatic Basal medium
Activin A Recombinant Human Protein Life Technologies PHG9014 For Pancreatic medium
Retinoic Acid Sigma R2625 For Pancreatic medium
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650 DMSO; for Retinoic Acid stock preparation
Insulin-Transferrin-Selenium Life Technologies 41400045 ITS; for Pancreatic Final medium
Anti-Vimentin antibody  Abcam ab8069 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Sigma 32670 DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution  1µg/ml
5-Methylcytidine Eurogentec MMS-900P-B For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500
Anti-C Peptide antibody  Abcam ab14181 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100
Anti-PDX1 antibody  Abcam ab47267 For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500
Mercodia Insulin ELISA Mercodia 10-1113-10 For insulin release detection

Referenzen

  1. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  3. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
  5. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  6. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  7. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
  8. Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
  9. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  10. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
  11. Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
  12. Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
  13. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
  14. Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
  15. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  16. Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
  17. Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
  18. Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained?. Development. 134 (4), 635-646 (2007).
  19. Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).

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Diesen Artikel zitieren
Brevini, T. A., Pennarossa, G., Maffei, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts. J. Vis. Exp. (109), e53880, doi:10.3791/53880 (2016).

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