La conversione epigenetico come un metodo semplice e sicuro per ottenere cellule che secernono insulina da adulti fibroblasti cutanei
Summary
Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.
Abstract
Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a “highly permissive” state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated “epigenetic cell conversion”. It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.
Introduction
Un obiettivo fondamentale della medicina rigenerativa è la generazione di nuove cellule funzionali che possono essere utilizzati per riparare o sostituire danneggiato, degenerata tessuti. Rifare cellule adulte facilmente disponibili in nuovi, convertendoli da un tipo di cellula all'altra, è un approccio particolarmente interessante, soprattutto quando la popolazione di cellule richiesta non è abbondante o di difficile accesso. Tuttavia, le cellule adulte sono molto stabili. Acquisiscono il loro stato differenziato attraverso una restrizione graduale nelle loro opzioni e, una volta raggiunta la specializzazione terminale maturo, hanno stabilmente conservarlo 1.
Negli ultimi anni sono state sviluppate una serie di protocolli, che consentono la riprogrammazione di pluripotenza di una cellula somatica (IPS) ottenuta attraverso l'espressione forzata di una serie di fattori di trascrizione 2,3. In alternativa, la conversione cella può essere ottenuto transdifferenziazione discendenza diretta, introducendo un unico 4 </sup> o una combinazione di fattori di trascrizione 5-7. Questa strategia non comporta il passaggio attraverso uno stato de-differenziati ma richiede elevata espressione della trascrizione specifici fattori 8.
Abbiamo recentemente sviluppato un protocollo di conversione basato sulla breve esposizione di cellule adulte alle proprietà demetilanti della citidina analogico 5-azacitidina (5-aza-CR), un inibitore della DNA metiltransferasi ben caratterizzato. Il passo demetilazione è immediatamente seguito da uno specifico protocollo di differenziazione 9-11 che permette di ottenere il fenotipo morsetto desiderato. Questo metodo è in grado di convertire maturi, cellule differenziate in cellule di diversa stirpe e presenta il notevole vantaggio di evitare sia l'uso di vettori virali e la trasfezione di eventuali fattori di trascrizione esogeni. L'acquisizione di uno stato pluripotente stabile, e il relativo aumento della suscettibilità alle cella instabilità è anche evitato.
<p class="Jove_content"> Il protocollo dettagliato che permette la conversione di adulti fibroblasti cutanei umani in cellule che secernono insulina completamente funzionale qui viene presentato. Tuttavia, è opportuno notare che la tecnica è stata applicata a diversi tipi di cellule ed ha generato risultati positivi, rivolgendosi cellule verso diverse vie di differenziazione. Inoltre, la conversione epigenetica è stato usato con successo nella specie umana e suina 9-13 e nel cane (manoscritto presentato) suggerendo un'ampia efficacia e la robustezza del metodo.Protocol
Representative Results
Discussion
La presente manoscritto descrive un metodo che permette la conversione dei fibroblasti della pelle umana in cellule che producono insulina, attraverso una esposizione transitoria e breve a 5-aza-CR, seguito da uno specifico protocollo di induzione tessuto. Questo approccio consente il passaggio da mesoderma alle cellule legate endoderma, senza l'espressione forzata di fattori di trascrizione o microRNAs né l'acquisizione di uno stato stabile pluripotenti, che rende le cellule più instabile e soggetto a errori …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Carraresi e Fondazione Europea per lo Studio del Diabete (EFSD). GP è supportato da una borsa di studio post-dottorato dell'Università degli Studi di Milano. Gli autori sono membri del COST FA1201 Epiconcept: ambiente epigenetica e Periconception e l'azione COST BM1308 condivisione avanza su grandi modelli animali (SALAAM). TALB è membro del COST CM1406 epigenetica Chemical Biology (EPICHEM).
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
Referenzen
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