录制鼠标超声波发声评价社会交往

伦理学声明：涉及动物主题程序已经批准科米特D'Ethique恩实验安尼米尔（CETEA）N°89在巴黎巴斯德研究所。 1.动物的制备要录制小狗隔离来电，感兴趣的小鼠品系获得怀孕女性。注：繁殖杂男性和女性获得至少10窝，包括野生型，杂合基因敲除的幼崽获得鲁棒控制动物。 获取两类成年小鼠的录制过程中同性相互作用发声。 获得至少12的男性或女性的每个基因型从感兴趣应变试验小鼠的12（考虑到个体间变异性）。注意：此协议是公适于成人的，但它可以在实验9之前进行调整，以青少年，具有降低的隔离时间。该测试适用于男性或女性。然而，要避免男性测试期从可显示在男男性社会交往测试一个明确的激进型小鼠品系。 为了最大限度地提高affiliative相互作用的量，在实验之前隔离试验动物。房子单独男性3周（减少侵略性互动到最低限度14,17），女性为3天（E. Ey和未发表的数据），以增加他们的社会动机。 获得男性或女性从株代表测试应变用它们作为新来者的遗传背景（ 例如，作为互动老鼠，见3.1.3）。例如，如果在C57BL / 6J背景已经生成所研究的突变体菌株，使用C57BL / 6J小鼠作为新来者。计算所需使得每个这些小鼠不使用一天的2倍以上为新来的动物的数量。房子他们组。 获取两类成年小鼠在发情期的女性存在来记录男性发声。 获取为L从感兴趣的菌株的每种基因型东12性成熟雄性（考虑到个体间变异性）。注意：如果男性从未有过的女性经验之前，把它们放在单独的笼子，让他们度过一个晚上与女性两天的测试，以增加他们的动机发出超声波发声6日前。 获得记录的男性的背景应变性成熟女性。例如，如果正在研究已在C57BL / 6J背景产生的突变体雄性，使用C57BL / 6J雌性。计算所需使得每个这些小鼠不使用一天3次以上的女性的数目。房子他们组。 2.小​​狗隔离电话小狗鉴定出生当天预测前三天，分离出怀孕女性。 检查出生每天早上和每天晚上的女性。注意诞生的那天为P0。 确定使用时间持久的爪子纹身（绿色文身的皮下注射用0.3毫米×13毫米[30 G½“]针贴）在P1的幼崽。创建标志着一个，两个，三个或四个爪子代码。要为快如可能，微创扰乱幼崽，并尽快将它们放回巢越好。 成立了凯奇记录小狗隔离通话。 使用一个自制的隔音室（ 图1A）或简单的泡沫塑料盒。放置箱内的温度计来监视每个记录的温度。确保温度保持在18°C和22℃之间。 放置一个麦克风在顶部（通过在箱的顶部的孔）。调整麦克风的高度，使麦克风的膜是12-15厘米的对话框，小狗会躺在底部上方。连接麦克风到声卡和声卡到计算机。 要调整SOU的增益第二卡，进​​行记录试验带，不会在实验中使用的小狗。把在相同条件下的小狗如在实验（见2.3.1）。关上门。调节声音卡上的增益，使得其上的最大值（具有用于所述发声最高幅度可能），但没有超载（检查在记录软件的实时频谱图上）。 注意：如果大多数通话的幅度保持在尽可能高的水平打了几个电话可能会超载。 注册为每个记录会话的增益级别，不幼仔/窝/会话之间改变。增益水平的变化会导致不准确的呼叫检测，并使用自动检测和测量（见5.1至5.4）的分析相同的阈值声变量的措施。 <str翁>图1：设置记录隔离从小鼠的幼崽和超声波发声的谱图调用（A）自制隔音室录制小狗的隔离调用的例子。在本呼叫类型分类所使用的不同的呼叫类型（B）的频谱图;看到说明如表1。 请点击此处查看该图的放大版本。 进行小狗隔离的记录每两天呼叫。进行录音早晨出生在夜间幼崽，并于当天下午在白天出生的，以避免在同一个年龄组的幼崽归类与年龄的差异半天幼崽。这是最明显的非常年轻的阶段P2和P4。 您可以在垃圾1小狗。以最快的速度，轻轻地将其放置在用10％乙醇和干燥（直径的塑料收件人：9厘米;高度：10厘米，以防止旧的幼崽从由麦克风覆盖的区域）逃逸。把收件人刚下麦克风。 关闭对话框迅速，默默地越好。开始在记录软件小狗超声波发声的记录（16位格式，300千赫的采样频率来捕获声音幅度高达150千赫的高品质）。 记录的所需的时间已经过去（最多5分钟）后，停止该记录。就拿小狗开箱。写下小狗的爪子纹身。 就拿小狗的腋温用探针温度计。马克它与带有异味少笔（水性油墨），认识到一个很小的点后面的小狗更容易在巢已记录的幼崽时，下一个选择，避免每次新的操纵所有幼崽选择。把小狗放回窝。 清洗塑料收件人和塑料覆盖其底部有10％的乙醇，干燥得很好前把小狗旁边里面。 选择在枯枝落叶下一个小狗，并重复2.3。 检查体重，运动协调，负趋地性，和发育标记（用于减少试验电池的细节，请参见在施迈瑟等人 18和Ey的等 19的方法部分）的期间1小时的休息后，以允许幼仔超声波发声的排气排放后恢复。如果完整发育试验电池如在Chadman 等人 20和Scattoni 等人 21进行使用动物的另一个队列。 重复这些录音P2和P12之间每隔两天来表征小狗声乐的行为和发展整个头两个星期的生活。 3.在同性社会交往超声波发声发声录音准备一个测试笼（50×25厘米×30℃米3;有机玻璃，100勒克斯[低强度的白光]）清洗用肥皂水，干燥和隔音室充满2厘米清新的床上用品。 放置使得从笼的所有角落发出叫声可以记录麦克风。固定在测试笼子的一个角落里的麦克风（无论是在笼子里或放在三脚架上），并调整角度麦克风笼底覆盖笼子的整个表面。 注：超声波探伤仪是非常方向性。 放置在隔音室的顶部的视频摄像机来捕获测试笼子的整个表面。 注意：检查麦克风是不是隐藏在视频测试笼的一角。 测试前，调整声卡的用备用男性和不会被在实验后所使用的备用母增益。把这些动物在记录室中的测试笼。调整声卡上的增益水平，最大限度地记录发声的幅度BU吨至减少超载所看到在录音软件实时频谱显示。 注意：增益取决于麦克风与发声动物之间的距离。 引进的动物进行测试（男性或女性，它会被称为“乘客”）在清新的床上用品测试笼子。离开它habituate至测试笼中的隔音室20分钟以最大限度地发挥其在3.1.3引入的未知同种的兴趣。 这个习惯时间之后，引入交互的第二届动物（男性或女性，性别相同的乘客，但不同的耳唛/爪子纹身后辨别出来，它会被称为“新来者”）。 开始录制超声波发声（16位格式，300 kHz采样率捕获声音振幅高达150 kHz的高品质）以及视频捕捉介绍在测试笼子里新来的。开始录制的U习惯（单独乘员）如果需要笼勘探和社会互动中发声发射的基线电平之间的比较期间ltrasonic发声。 通过在时间紧迫的手表（传声器近“BIP”的声音）是在什么时候新来的老鼠的后爪着地手动同步/视音频和视频录制。 离开两种动物所需时间（例如4分钟，持续时间足以收集足够的超声波发声）相互作用。 把乘员和新来的人回到各自的家笼。清空使用的床上用品从测试笼，用肥皂清水冲洗，并用纸巾擦干。把新鲜的床上用品，并把它重新下一次测试隔音室。 4.男发声期间，与发情雌性互动测试的清晨天男性，取阴道涂片，从每一位女性来确定发情周期内的性状态。 尾巴抓住女性和她保持上笼网格。使用吸管以20微升的PBS冲洗阴道几次（ 即注入和回忆同20微升PBS几次）。具有相同的移液管尖回忆20微升PBS中。使用无菌PBS，以避免任何感染如果女性是连续数天进行测试。 涂布到含有阴道细胞上的滑动悬架的PBS中。把四个样品上的一个滑板（标识个人在滑动的用铅笔的一侧）。让幻灯片在进行染色前干燥。 实验室通风柜下工作。 制备纯月-Grünwald的之一浴，磷酸盐缓冲液（0.1M）和（在磷酸盐缓冲液1/20）吉姆萨一个R浴一浴。 把载玻片在纯月-Grünwald的的浴3分钟，然后冲洗它们的1分钟的磷酸盐缓冲溶液的浴中，最后（在磷酸盐缓冲液1/20）传送它们10分钟在吉姆萨R的浴中。 在这之后，再次冲洗载玻片在磷酸盐缓冲溶液的浴中10秒，并让它们干燥。 检查显微镜下的染色切片。可以在白天使用女性是那些样品目前只有大的角化上皮细胞（无细胞核，在蓝染色;全发情）。 测试之前把男性在试验室至少30分钟。 发声录音如有必要，重复3.1。 介绍要测试的男性（新鲜床上用品）。离开他habituate至测试笼中的隔音室10分钟。 这个习惯时间之后，引入在发情期女性（从染色选择那些中）。 开始录制超声波发声和视频捕捉到在测试笼子里引进的女性。开始习惯（雄性单独）如果需要笼勘探和社会互动中发声发射的基线电平之间的比较期间记录所述超声波发声。 通过在时间紧迫的手表（传声器近“BIP”的声音）恰好在雌性小鼠的后爪着地手动同步/视音频和视频录制。 离开两种动物所需时间（例如4分钟，持续时间足以收集足够的超声波发声）相互作用。 把阳和阴背部在其各自的家笼中。清空使用的床上用品从测试笼，用肥皂清水冲洗，并用纸巾擦干。把新鲜的床上用品，并把它重新下一次测试隔音室。 注：这是最佳的每一天只能一次使用每个发情雌性（但如果需要它可以使用高达3倍的同一天，但不是在一个行）。 5.变量要提取准备音频文件的分析。注意：下面的步骤是特定的一种visoft SASLab临 ，并且可以根据所使用的软件变化。 切文件，以便它们在时间腕表“BIP”恰好开始，并且所需的持续时间（5分钟的小狗录像，录音成人4分钟）之后结束。 （;高通以30 kHz的频率切断编辑>滤镜> FIR时域滤波器）通过使用高通滤波器滤除在30千赫的幅度。使用批处理来筛选的利息（操作>批处理> FIR滤波器）的所有文件。 通过与软件被贴上标识每个超声波发声。 使用小狗录音自动检测（工具>标签>创建波形事件部分标签）。调整门槛，保持时间和边缘f还是最准确的检测。手动检查检测，必要时（推荐）调​​整标签。 使用成人用录音的背景噪音的视觉检测（标签手动插入）​​（选择发声，点击右键，然后从标记插入分节标签）。 创建谱图。激活自动参数测量（工具>自动参数测量>自动参数测量设置）。 选中“启用自动测量”，“从整个频谱计算参数”和“自动更新”复选框。选择“元素分离”：以交互方式（部分标签）。 复选框来计算所需的时间参数，并基于频谱的参数（峰值频率）（元，时间间隔，开始/结束时间的持续时间），以及测量位置（元素开始，元素结束，平均值，最大值，最小值） 。 复制测量并粘贴米的电子表格。 注意：对于与成人进行录音，基于频谱参数测量可能会因为背景噪音是不可能的。通过点击不同的频率值上直接频谱和在表手动粘贴的值，用峰值频率的手动测量。 通过首先确定发射发声的数量（标签总数）确定呼叫速率， 即，每分钟的呼叫数。然后，除以该文件的持续时间（以分钟为单位）记录的发声总数计算出的传输率。 确定时间的组织， 即调用来确定序列组织之间的时间间隔分布。 计算发声n的端部和发声的n + 1的使用各标签的开始/结束时间的开始之间的时间间隔。 建立了Ultrason之间的时间间隔的分布密度IC发声。 确定通话剧目， 即定义出现在记录的呼叫类型。使用分级在表1和图1B介绍的例子。 当5.1.3标记各个发声，写在标签中的呼叫类型的名称。 计算出准确的数量和每个呼叫类型建立声剧目的比例。 确定每个发声， 即，持续时间，峰值频率的声学特性（ 例如，具有最高振幅频率）在开始和呼叫，最大和最小峰值频率的端部，并平均频率，如果自动测量是可能的（ 图1B） 。 使用自动参数测量功能，在软件中自动测量持续时间，峰值频率特性小狗的记录（ 例如 ，开始，结束，平均值，最大值，最小值）。 </li> 使用的标签的持续时间作为发声成人记录的持续时间。手动测量谱图窗口中的峰值频率特性（ 例如，开始，结束，最大值，最小值）上。 夫妇超声波发声数据和社交互动数据（从冰冷的平台22 MiceProfiler插件）。 确保为精确同步地将音频和在协议中所描述的视频记录。 使用ICY平台的小鼠探查器跟踪插件在肖蒙等 22所描述的编码社会互动的视频。恰好开始跟踪时引入的动物的后爪接触地面。 上传编码的视频文件和相应的XML文件中的ICY平台的小鼠探查视频标签制作插件（通过小鼠探查器跟踪生成）在肖蒙等描述人22。 注： 老鼠探查视频标签制作插件会自动链接视频文件和音频文件的分析产生的，如果他们有相同名称的文本文件（参见：http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Maker） 。 检查鼠标规模是正确后，点击“创建USV统计”为每个文件，以获得数量和分离的文件中的每个社交活动时发出发声的比例。 6.上传文件的mouseTube数据库确保文件是可以从机构外部访问存储服务器上。 注：在一些机构高安全级别的托管的服务器需要一个特定的配置，以从机构以外人们连接访问。 进入mouseTube网站（http://mousetube.pasteur.fr）。登录（登录本第二密码由管理员分配给每个用户）。 检查已经记录的小鼠品系是否通过点击“应变”按钮，在mouseTube数据库中存在。如果没有，请管理员来创建它。 创建使用科目“科目>创建”按钮。输入记录动物的识别码。收集他们组来缓解数据进行检索。 输入用于记录使用超声波发声“协议>创建”按钮协议的描述。 使用每个记​​录会话创建实验“实验>创建”按钮。指定协议，这已被记录，硬件和使用的软件和其特异性的组的个人。 注：实验收集所有相应的发声文件的元数据。 创建使用“Vocalisations链接到发声文件>新建＆＃34;按钮。选择列表中的实验。复制并粘贴发声文件的URL（此链接以http：// …）插入的相应字段“文件链接”一栏。通过点击按钮，验证项目“创建mouseTube和文件之间的链接。” 注意：它不要求在同一时间，以填补对每个文件中的每个框。 如有必要，修改在任何时候进入的链接，而“注意事项”一节中添加详细信息。不要犹豫，写下笔记透露更多的细节。举例来说，如果朝这与音频文件同时记录的视频文件的链接已输入，这可以在“说明”中指定。