Fluorescência tempo-lapso da completa<em> S. venezuelae</em> Ciclo de Vida Usando um dispositivo micro
Summary
Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.
Abstract
Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties.
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.
Introduction
Streptomycetes são bactérias que vivem no solo, que se caracterizam por um ciclo de desenvolvimento complexo envolvendo diferenciação morfológica a partir de, um micélio multicelular de remoção de nutrientes para dormentes, esporos unigenomic 1-3.
Sob condições favoráveis de crescimento, um esporo Streptomyces típicos começa a germinar por extrusão de um ou dois tubos germinais (Figura 1). Estes tubos alongados por extensão ponta e crescer em uma rede de hifas ramificadas conhecido como o micélio vegetativo. crescimento polar e ramificação das hifas é dirigido pelo DivIVA proteína essencial. Esta proteína de filamento helicoidal é parte de um grande complexo citoplasmático chamado o polarisome, que é crucial para a inserção de material novo envelope celular na ponta que se estende 4-7. Durante o crescimento vegetativo, os filamentos tornam-se hifas compartimentada pela formação frequente de chamadas paredes transversais 8. A formação destas paredes transversais re quires FtsZ, a proteína do citoesqueleto afim da tubulina, que é essencial para a divisão celular na maioria das bactérias 9. Em Streptomyces, no entanto, estas paredes transversais vegetativas não conduzem à constrição e célula-célula de separação e, por conseguinte, a massa de micélio permanece como uma rede de compartimentos interligados sinciciais. Em resposta a limitação de nutrientes e de outros sinais que não são bem compreendidos, hifas aéreas especializado romper a partir do micélio vegetativo e crescer para o ar 3. A construção destas estruturas inicia a fase de desenvolvimento reprodutivo, durante o qual a longa hifas aéreas multi-genómico tornar-se dividida em dezenas de compartimentos prespore unigenomic de tamanho igual. Este evento divisão celular massiva é impulsionado pela constrição síncrono de múltiplos anéis FtsZ numa única esporogênico 2,10 hifas. diferenciação morfológica é completado pela liberação de dormentes, esporos, pigmentadas de paredes espessas.
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Figura 1:. O ciclo de vida de Streptomyces em meios sólidos Este é um modelo do ciclo de vida com base em estudos clássicos de S. coelicolor crescimento em placas de agar. O desenvolvimento celular de um esporo começa com a formação de um ou dois tubos germinais, que crescem por extensão ponta para formar uma rede de hifas ramificadas. crescimento polar e ramificação das hifas vegetativas é dirigido por DivIVA (vermelho). A formação de paredes transversais vegetativas requer FtsZ (verde). Em resposta às limitações de nutrientes e de outros sinais, hifas aéreas são erguidas. Prisão de crescimento aéreo está estreitamente coordenada com a montagem de uma escada de FtsZ-rings, que dão origem aos septos esporulação que compartimentalizar as hifas esporogênico em compartimentos prespore box-like. Estes compartimentos montar uma parede de esporos de espessura e, eventualmente, são RELEAsed esporos pigmentados como maduros.
Os eventos de desenvolvimento chave do ciclo de vida de Streptomyces estão bem caracterizados 1,3. No entanto, o que ainda é escasso são estudos com células biológicas que empregam microscopia de lapso de tempo de fluorescência para fornecer informações sobre os processos subcelulares que sustentam a diferenciação, como a dinâmica de localização de proteínas, o movimento dos cromossomas e divisão celular developmentally controlada. Processamento de imagem de células vivas do desenvolvimento Streptomyces tem sido um desafio devido à complexidade do ciclo de vida e as características fisiológicas do organismo. Estudos anteriores sobre o crescimento vegetativo e as fases iniciais da formação de septos esporulação empregaram câmaras de imagem permeável ao oxigénio, ou o crescimento de agarose-suportado de Streptomyces coelicolor num palco de microscópio 11-15. Estes métodos, no entanto, está limitado por um número de factores. Alguns sistemas só permitem imagiologia de curto prazo de um crescimento celulard proteínas fluorescentes antes que as células sofrem de fornecimento de oxigénio insuficiente ou crescer para fora do plano focal devido ao padrão tridimensional de desenvolvimento de hifas. Nos casos em imagiologia de longo prazo é possível, as células sobre os limites de almofadas de agarose flexibilidade experimental cultivo porque as células não podem ser expostos a condições de crescimento ou de stress alternativos, e a fluorescência de fundo do meio nas almofadas de agarose limita severamente a capacidade de monitorar fluorescente fraco sinais.
Aqui nós descrevemos um protocolo para a criação de imagens de células vivas do ciclo de vida completo Streptomyces com excelente precisão e sensibilidade. Ao cultivar Streptomyces num dispositivo de microfluidos ligado a um microscópio de fluorescência widefield (Figura 2), que agora são capazes de monitorizar a germinação, o crescimento vegetativo e a formação de septos esporulação ao longo de um período de tempo de até 30 horas. Isto é muito facilitada pela utilização dos novos Streptomyces organismo modelo </em> venezuelae porque esporula a conclusão perto em cultura submersa e desse modo ultrapassa a limitação da espécie S. modelo clássico coelicolor, que esporula apenas em meios sólidos 16-20. Para ajudar a visualizar o crescimento vegetativo e esporulação, que co-expressam fluorescente etiquetado versões do DivIVA marcador polaridade celular ea proteína divisão celular chave FtsZ.
Nós estamos usando um dispositivo microfluídico disponível comercialmente que tem sido empregada com sucesso para micobactérias, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis e fermento 21-25. O sistema retém as células num único plano focal e permite o controlo da perfusão contínua do meio de cultura a partir de reservatórios diferentes. No protocolo detalhado que aproveitar este recurso para expor S. venezuelae micélio vegetativo de uma redução de marcha nutricional para promover a esporulação.
O protocolo decrito é para geração de imagens ao vivo de células de todo o ciclo de vida Streptomyces, mas as condições mídia alternativa ou configurações de microscópio pode ser escolhido se estágios de desenvolvimento específicas são de particular interesse.
Figura 2: Esquema representando o fluxo de trabalho experimental. Os três passos principais descritos no protocolo são mostrados. Em primeiro lugar, os esporos e o meio gasto são preparados a partir de uma cultura de fase estacionária. Em segundo lugar, os esporos frescos são carregados para um sistema de microfluidos e S. venezuelae é trabalhada por todo o seu ciclo de vida de desenvolvimento usando um microscópio invertido completamente automatizado, com uma câmara de incubação para manter uma temperatura óptima de crescimento. Em terceiro lugar, a série de lapso de tempo obtidos são analisados e processados usando o software de código aberto Fiji.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microscopia de lapso de tempo do ciclo de vida Streptomyces tem sido tecnicamente desafiador no passado. Aqui apresenta-se um protocolo robusto para realizar processamento de imagem de células vivas do ciclo de vida completo utilizando fusões de proteínas fluorescentes para o marcador DivIVA polaridade celular e a divisão celular proteína FtsZ para ajudar a visualizar e detectar a progressão através do programa de desenvolvimento (Figura 2).
Central ao presente método é a cultura de S. venezuelae em um dispositivo micro que permite perfusão média constante e a troca de meio de crescimento normal (MYM-TE) com meio gasto (gasto MYM-TE). A mudança de condição de cultura é importante para o protocolo descrito porque o downshift nutricional como poços como quaisquer sinais extracelulares ainda não identificados (por exemplo, detecção do quórum sinais) no meio de cultura gasto, promover a esporulação, ao passo que um fornecimento contínuo de meio rico em nutrientes estimula growt vegetativoh, com quase nenhuma formação de esporos (dados não mostrados). Assim, a cultura de células neste sistema microfluídico é superior para a cultura de células em agarose, pois oferece uma maior flexibilidade e experimental permite a monitorização de longo prazo de alterações de crescimento bacteriano em resposta à mudança das condições de cultura. Embora as placas microfluídicos são projetados para uso único, o fluxo canais que não foram inoculados com células podem ser utilizados em experiências posteriores. Recomendamos a utilização de todos os canais de uma placa de microfluidos dentro de uma semana, como temos experimentado problemas de vedação do colector de placas que foram abertas por mais tempo.
Quando da criação de uma experiência, verificou-se que os esporos preparados de fresco germinado dentro de duas horas de serem carregados para dentro da câmara de fluxo, enquanto que os esporos derivados de um estoque de glicerol congelado necessária, pelo menos, 6 horas antes de tubos germinais, emergiu (dados não mostrados). Este atraso na germinação prolonga a duração da experiência e podem interferir coma disponibilidade do equipamento e das condições experimentais. É também importante para iniciar a experiência com a perfusão de PJM-TE para, pelo menos, três horas para proporcionar nutrientes suficientes para o desenvolvimento e crescimento de tubos germinativos. Perfusão com MYM-TE pode ser estendido para além do 3 hr inicial se o experimento é projetado para estudar o crescimento vegetativo. Enquanto esporos proporcionar a escolha de material de partida preferido, os fragmentos de hifas curta também pode ser carregado para a placa de microfluidos. No entanto, a eficiência de carga quando se utiliza micélio cortado é significativamente menor e muitas vezes requer várias corridas de carga que pode ser uma limitação ao examinar mutantes não-esporulantes. Independentemente do tipo de inóculo utilizado, é importante não sobrecarregar a câmara de cultura com esporos ou fragmentos de hifas como isso vai levar a superlotação rápida, que pode interferir com a difusão da mídia e complicar a análise de imagem.
É importante planejar a construção de proteínas repórter carefully para uso na fluorescência de imagem time-lapse em Streptomyces. comprimento do ligante entre a proteína alvo e o repórter fluorescente e a escolha de N- ou fusões de terminal C pode ser crítica. Além disso, as condições experimentais ótimas, incluindo a frequência de imagem e tempo de exposição, precisa ser determinado antecipadamente para cada proteína fluorescente-marcadas. S. venezuelae hifas exibem auto-fluorescência no canal verde / amarelo, que pode tornar-se problemática quando imagiologia de uma proteína marcada com fluorescência que é expressa em níveis baixos. Além disso, deve notar-se que, durante a germinação e a fase de crescimento vegetativo inicial, S. venezuelae é particularmente sensível à luz de curto comprimento de onda (por exemplo, quando se utiliza proteínas de fusão para PCP).
Apesar dos contínuos avanços nas técnicas de imagem e sistemas repórter fluorescentes para imagens ao vivo de células de bactérias, a maioria dos pacotes de software (por exemplo MicrobeTracker, Schnitzelcells, CellProfiler) para o processamento automatizado subsequente destes tipos de conjuntos de dados não suportam a análise de imagens derivadas de bactérias filamentosas com um estilo de vida multicelular 27-29. Assim, existe uma necessidade de desenvolver um algoritmo adequado para a análise de alto rendimento quantitativo de dados de imagem a partir de Streptomyces e outras bactérias filamentosas.
Em resumo, o trabalho aqui descrito demonstra o imenso potencial de S. venezuelae como um novo sistema de desenvolvimento modelo para o género, devido à sua capacidade de esporulação em líquido. O dispositivo microfluídico cultura é simples de usar, mesmo para usuários inexperientes. Ele fornece uma excelente plataforma para estudar processos biológicos celulares centrais para o ciclo de vida Streptomyces, incluindo localização dinâmica de proteína, o crescimento polarizado, ea diferenciação morfológica de um micélio multicelular em cadeias de esporos unigenomic. Além disso, este conjunto experimental up também fornece um ponto de partida atraente para investigar acontecimentos do desenvolvimento que requerem alternadas condições de cultura, ou a utilização de corantes fluorescentes, tais como D-aminoácidos fluorescentes para monitorizar a síntese do peptidoglicano ou iodeto de propídio e 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) organização de visualizar cromossoma 30,31.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Grant Calder for technical assistance with the microscope, Matt Bush for comments on the protocol, and the John Innes Centre for purchase of the Zeiss widefield microscope. This work was funded by BBSRC grant BB/I002197/1 (to M.J.B), by BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 to the John Innes Centre, by Swedish Research Council grant 621-2010-4463 (to K.F.), and by a Leopoldina Postdoctoral Fellowship (to S.S.).
Materials
| B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells | Merck-Millipore | B04A-03-5PK | Microfluidic culture plates |
| CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2) | Merck-Millipore | EV-262 | The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | 431007-9902-000 | Fully automated and motorized inverted widefield microscope |
| Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2 | Zeiss | 411857-9061-000 | Environmental chamber surrounding the microscope |
| Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective | Zeiss | 420792-9800-000 | |
| Ocra FLASH 4 V2 | Hamamatsu Photonics K.K. | C11440-22CU | |
| Illuminator HXP 120V | Zeiss | 423013-9010-000 | |
| FL Filter Set 46 HE YFP shift free | Zeiss | 489046-9901-000 | Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm |
| FL Filter Set 63 HE RFP shift free | Zeiss | 489063-0000-000 | Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm |
| Mounting frame K-M for multiwell plates | Zeiss | 000000-1272-644 | Stage holder for microfluidic plate |
| ZEN pro 2012 | Zeiss | 410135-1002-120 | Microscope control software |
| ZEN Module Time Lapse | Zeiss | 410136-1031-110 | Software module to set up time-lapse microscopy experiments |
| ZEN Module Tiles/Positions | Zeiss | 410136-1025-110 | Software module to save specific stage positions (xzy) |
| Fiji | open-source software package | http://fiji.sc/Fiji | Generation of time-lapse movies |
| Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM) 4 g Maltose 4 g Yeast extract 10 g Malt extract add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving |
Sporulation medium used to culture S. venezuelae SV60 | ||
| R2 Trace element solution (TE) 8 mg ZnCl2 40 mg FeCl3-6H2O 2 mg CuCl2-2H2O 2 mg MnCl2-4H2O 2 mg Na2B4O7-10H2O 2 mg (NH4)6Mo7O24-4H2O add 200 ml H2O Autoclave and store at 4 oC |
Add 0.002 volumes to MYM | ||
| PBS (phosphate buffered saline) | Sigma | P4417-100TAB | Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage. |
| 0.22 µm syringe filters | Satorius stedim | 16532-K | Preparation of spent MYM-TE |
| SV60 | John Innes Centre strain collection | S. venezuelae strain expressing divIVA-mcherry and ftsZ-ypet |
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