Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Susan Schlimpert; Klas Fl&#228;rdh; Mark J. Buttner

doi:10.3791/53863

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Immunologie und Infektion

Fluorescentie Time-lapse beeldvorming van de volledige S. venezuelae Life Cycle Met behulp van een microfluïdische apparaat

Published: February 28, 2016

doi:

10.3791/53863

Susan Schlimpert¹, Klas Flärdh², Mark J. Buttner¹

¹Department of Molecular Microbiology,John Innes Centre, Norwich Research Park, ²Department of Biology,Lund University

Summary

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Abstract

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties.

Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

Introduction

Streptomyceten zijn bodem levende bacteriën die worden gekenmerkt door een complexe ontwikkelingsstoornis cyclus waarbij morfologische differentiatie van een meercellige, voedingsstoffen wegvangen mycelium slapende, unigenomic sporen ^1-3.

Onder gunstige groeiomstandigheden, een typische Streptomyces spore begint te ontkiemen door het extruderen één of twee kiembuizen (figuur 1). Deze buizen verlengen door tip uitbreiding en uitgroeien tot een vertakt hyphal netwerk bekend als het vegetatieve mycelium. Polar groei en hyfen vertakking wordt geleid door de essentiële eiwit DivIVA. Het coiled-coil eiwit behoort tot een grote cytoplasmatische complex genaamd de polarisome, wat cruciaal is voor het invoegen van nieuwe celwand materiaal op het uitstekende uiteinde ^4-7. Tijdens de vegetatieve groei, de hyfen filamenten worden gecompartimenteerd door de onregelmatige vorming van zogenaamde dwarswanden ^8. De vorming van deze cross-muren opnieuw katernen FtsZ, de tubuline-achtige cytoskelet eiwit dat essentieel is voor celdeling meeste bacteriën ^9. In Streptomyces, maar deze vegetatieve dwarswanden niet leiden tot vernauwing en cel-celscheiding en daarom blijft de mycelia massa een netwerk van onderling verbonden syncytieel compartimenten. In reactie op de beperking van voedingsstoffen en andere signalen die niet goed worden begrepen, gespecialiseerde antenne schimmeldraden breken met het vegetatieve mycelium en te groeien in de lucht ^3. Bouw van deze structuren initieert de reproductieve ontwikkelingsfase, waarbij de lange multi-genomische antenne hyfen worden verdeeld in tientallen gelijke grootte unigenomic prespore compartimenten. Deze massale celdeling event wordt gedreven door de synchrone samentrekking van meerdere FtsZ ringen binnen enkele sporogene schimmeldraden ^2,10. Morfologische differentiatie wordt gecompleteerd door het vrijkomen van slapende, dikwandige, gepigmenteerde sporen.

t "fo: keep-together.within-page =" 1 ">

Figuur 1:. De Streptomyces levenscyclus op vaste media Dit is een model van de levenscyclus gebaseerd op klassieke studies van S. coelicolor groeien op agar-platen. De cellulaire ontwikkeling van een sporensuspensie begint met de vorming van een of twee kiembuizen, die groeien tipverlengstuk een netwerk van vertakkende hyfen vormen. Polaire groei en vertakking van de vegetatieve hyfen wordt geleid door DivIVA (rood). De vorming van vegetatieve dwarswanden vereist FtsZ (groen). In reactie op nutriënt beperkingen en andere signalen, zijn lucht hyfen opgetrokken. Arrestatie van luchtfoto groei is nauw gecoördineerd met de montage van een ladder van FtsZ-ringen, die aanleiding geven tot de sporulatie septa dat de sporogene hyfen in doosvormige prespore compartimenten hokjes geven. Deze compartimenten assembleren een dikke spore muur en zijn uiteindelijk Released als volwassen gepigmenteerde sporen.

De sleutel ontwikkelingsstoornissen gebeurtenissen van het Streptomyces levenscyclus zijn goed gekarakteriseerd ^1,3. Maar wat is nog schaars zijn celbiologische studies die fluorescentie time-lapse microscopie gebruiken om inzicht te geven in de sub-cellulaire processen die ten grondslag liggen differentiatie, zoals eiwitten lokalisatie dynamiek, chromosoom beweging en ontwikkelingsgebied gecontroleerde celdeling. Live-cell imaging van Streptomyces ontwikkeling uitdagend vanwege de complexiteit van de levenscyclus en de fysiologische kenmerken van het organisme. Eerdere studies vegetatieve groei en de beginfase van sporulatie septation hebben zuurstofdoorlatende imaging kamers, of agarose-ondersteunde groei van Streptomyces coelicolor op microscooptafel ^11-15 toegepast. Deze werkwijzen zijn echter beperkt door een aantal factoren. Sommige systemen staan alleen op korte termijn beeldvorming van cellulaire groei eend fluorescerende eiwitten voor cellen ontoereikend is zuurstof of groeien uit het brandvlak door het driedimensionale patroon van hyphal ontwikkeling. Wanneer langdurige beeldvorming mogelijk is, kweken cellen op agarose pads grenzen experimentele flexibiliteit omdat de cellen niet worden blootgesteld aan groeimedia of stressomstandigheden en de achtergrondfluorescentie van het medium in de agarose pads ernstig beperkt de mogelijkheid om zwakkere fluorescentie monitoren signalen.

Hier beschrijven we een protocol voor live cell imaging van de volledige levenscyclus van Streptomyces met uitstekende precisie en gevoeligheid. Door te groeien Streptomyces in een microfluïdische apparaat is aangesloten op een fluorescentie microscoop groothoek (figuur 2), zijn we nu in staat om te ontkiemen, vegetatieve groei en sporulatie septation bewaken over een periode van maximaal 30 uur. Dit wordt sterk vergemakkelijkt door het gebruik van het nieuwe model organisme Streptomyces venezuelae omdat het sporuleert tot bijna voltooid in ondergedompelde cultuur en daarmee overwint de beperking van het klassieke model soort S. coelicolor, die op sporuleert op vaste media ^16-20. Om u te helpen visualiseren vegetatieve groei en sporulatie, we co-express fluorescent gelabeld versies van de cel polariteit marker DivIVA en de sleutel celdeling eiwit FtsZ.

We maken gebruik van een commercieel beschikbare microfluïdische apparaat dat met succes is toegepast voor mycobacteriën, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis en gist ^21-25. Het systeem vangt cellen in één brandvlak en maakt de besturing van continue perfusie kweekmedium uit verschillende reservoirs. In de gedetailleerde protocol maken we gebruik maken van deze functie om S. bloot venezuelae vegetatieve mycelium tot een nutritioneel terugschakelen naar sporulatie te promoten.

Het protocol dealle beschreven is voor levende cellen beeldvorming van het gehele Streptomyces levenscyclus, maar alternatieve mediaomstandigheden microscoop of instellingen kunnen worden gekozen indien specifieke ontwikkelingsstadia van bijzonder belang.

Figuur 2: schematische afbeelding van het experimentele werk-flow. De drie belangrijkste stappen in het protocol beschreven worden getoond. Eerst, sporen en verbruikte medium worden bereid uit een stationaire-fase kweek. Ten tweede worden de verse sporen geladen in een microfluïde systeem en S. venezuelae afgebeeld gedurende de ontwikkeling levenscyclus met een volledig geautomatiseerde omgekeerde microscoop met een incubatiekamer een optimale groeitemperatuur handhaven. Ten derde wordt de time-lapse-serie verkregen geanalyseerd en verwerkt met behulp van de open-source software Fiji.

Protocol

1. Isolatie van S. Fresh venezuelae Sporen en voorbereiding van verbruikte Cultuur Medium Inoculeer 30 ml Maltose-gistextract-Malt Extract (MYM) medium, aangevuld met 60 pl R2 sporenelementen oplossing (TE), met 10 ui sporen van stam SV60 [attB φ BT1 :: pSS209 (P divIVA – divIVA-mCherry P ftsZ -ftsZ-ypet)]. Consistente groei en sporulatie van de cellen, gebruik een van schotten voorziene fles of kolf die een veer bevat om voldoende beluchting. Kweekcellen 35-40 uur bij 30 ° C en 250 rpm. Onderzoek de cellen door vloeibare gemonteerd fase-contrast microscopie. Op dit punt myceliumfragmenten en sporen zichtbaar zijn. Centrifugeer 1 ml cellen in een tafelblad centrifuge bij 400 xg gedurende 1 min naar het mycelium en grotere celfragmenten pellet. Breng ongeveer 300 ul supernatant containing een suspensie van sporen naar een nieuwe 1,5 ml buis en blijf op ijs. Houd de resterende kweekmedium voor stap 1.7. Verdun sporen 01:20 in MYM-TE (uiteindelijke concentratie: 0,5-5 x 10 7 sporen / ml) en blijf op ijs totdat het nodig is (zie stap 2.3). Let op: Hoewel de exacte omstandigheden die leiden tot sporulatie in Streptomyces niet begrepen worden, met behulp van brachten MYM-TE medium, met inbegrip van een onbekende extracellulaire signalen van een sporulerende cultuur, stimuleert sporulatie. Filter-steriliseer 10 ml van het overblijvende kweekmedium te verkrijgen brachten MYM-TE die vrij van sporen en mycelium fragmenten. Gebruik een steriele 0,22 pm spuitfilter en overdracht besteed MYM-TE in een steriele 15 ml buis. Houd de bereide doorgebracht MYM-TE voor een paar dagen bij 4 ° C of aanvullende experimenten met vergelijkbare groeiomstandigheden te worden uitgevoerd. 2. Bereiding van de microfluïdische apparaat Opmerking: Elke microfluïdische plate kunnen maximaal vier onafhankelijke experimenten uit te voeren. Om besmetting van de ongebruikte stroom kamers te vermijden, gebruiken steriele oplossingen en de arbeidsvoorwaarden bij het opzetten van een experiment. Verwijder de scheepvaart oplossing uit de microfluïdische plaat en spoel de putten met steriel MYM-TE. Voeg 300 ul TE-MYM goed 1 en 300 gl TE brachten MYM-inlaat aan putjes 2-6. Load 40 pi verdund sporen van stap 1.6 in cel laadhouder 8 van baan "A" en sluit de verdeler aan de plaat volgens de instructies van de fabrikant. Start de microfluidics control software, selecteert u de juiste typeplaatje en het opzetten van een stroom programma om prime het stromingskanaal en cultuur kamer door vloeiend medium van inlaat putten 1-5 6 psi gedurende 2 minuten per well. In de microfluidics besturingssoftware, maakt een stroom protocol voor het experiment: stromende MYM-TE van inlaat en 1 tot 6 uur om voor ontkieming en vegetatieve groei van de cellen. Schakelaarvervolgens perfusie van verbruikte MYM-TE en van 2 tot 5 voor de resterende tijd van het experiment. In de loop van het experiment te houden stromingsdruk constant op 6 psi (overeenkomend met ongeveer 9 gl medium / uur). Begin stroom programma na stap 3.5. 3. Instellen van de microscoop en de Time-lapse Protocol Opmerking: Deze methode is op een volledig gemotoriseerde en geautomatiseerde omgekeerde groothoek microscoop uitgerust met een sCMOS camera, een metaalhalogenide lamp, een hardware autofocus, een podium houder 96 putjes en een klimaatkamer uitgevoerd. Pre-warm de klimaatkamer tot 30 ° C vooraf teneinde problemen de autofocus na aanvang van de proef voorkomen. De tijd hangt af van de klimaatruimte gebruikt, de microscoop en het verwarmingssysteem. Start om op te warmen het systeem de avond voor het experiment. Schakel de microscoop en microscopie automatisering en controle Softwaopnieuw. Gebruik een hoge numerieke apertuur (NA) olie-immersie objectief voor een optimale signaal verzamelen en ruimtelijke resolutie, zoals een 100X, 1,46 NA olie DIC doel. Selecteer de juiste filters en tweekleurig spiegels om differentiële interferentie contrast (DIC) beelden en afbeeldingen van geel-fluorescerende en rood fluorescerend eiwit fusies te verwerven. Een druppel immersie olie op het doel en voeg immersievloeistof onderaan de beeldvormende venster op de microfluïdische plaat cel-concentratie tijdens beeldverwerving verbeteren. Monteer zorgvuldig de afgedichte microfluïdische inrichting (stap 2,5) op het stadium van het omgekeerde microscoop. Zorgen dat de plaat vast in de fase houder wordt geplaatst en niet verschuift in de loop van het experiment. Breng de beeldvorming raam van de microfluïdische kweekkamer in beeld met behulp van de ingebouwde positie markers voor oriëntatie. Scherpstellen op het meest linkse gedeelte van de eerste stromingskamer (aangeduid "A") met de val grootte 5, overeenkomend meteen val hoogte van 0,7 urn. In de microfluidics software, load cells van inlaat en 8 bij 4 psi gedurende 15 sec. Controleer de celdichtheid in de cultuur kamer door het bewegen van de etappe over de beeldvorming raam. Als er geen sporen werden opgesloten, herhaalt u de cel laden stap of als alternatief verhoging van de laaddruk en / of de tijd totdat de gewenste cel dichtheid is bereikt (10/01 sporen per imaging venster met 2048 x 2048 pixels). Vermijd overbelasting van de cultuur kamer. Let op: We normaal gebruik val maat 5 voor het afbeelden van Streptomyces, maar we hebben ook goede resultaten verkregen met val maten 4 en 3. Raadpleeg de handleiding van de leverancier voor aanvullend advies over het optimaliseren van de cel laadproces. Start de stroming programma in de besturingssoftware uit stap 2.5 en laat de microfluïdische plaat aan warmte-evenwicht gedurende 1 uur in de microscoop podium vóór het begin van het acquisitie. In de microscoop control software, het opzetten van een multi-dimensionale overname mu nemenltiple beelden op meerdere podium posities in de tijd: Voor Automatisch opslaan: geef directory voor het automatisch opslaan van de beeldbestanden. Voor de verlichting in Bepaal de optimale belichtingsinstellingen voor elke specifieke construct van tevoren. Voor de geschetste experiment, gebruik dan de volgende belichtingstijden: DIC 150 msec, YFP 250 msec, RFP 100 msec. Voor Time-serie: het opzetten van een tijdreeks om beelden op het gewenste tijdstip punten in de juiste volgorde te verwerven. Voor het afbeelden van de levenscyclus van S. venezuelae, selecteer een 40 min tijdsinterval gedurende een periode van 24 uur. Voor Stage standpunten en autofocus: scan de cultuur kamer door het verplaatsen van het podium en op te slaan podium posities voor elke imaging positie van belang. Zorg ervoor dat de enkele fase posities bevinden zich voldoende van elkaar te minimaliseren fotobleken en phototoxicity.Typically gebruik tot 12 posities. Run autofocus routine voor elk tijdstip te corrigeren voor langzame focale drift. Indien beschikbaar in de microscoop besturingssoftwareStel autofocus strategie om "lokale oppervlakte-update door de hardware autofocus". Zodra de Z-coördinaten van de geselecteerde podium posities zijn gecontroleerd, activeert de hardware autofocus. Start de time-lapse experiment in de microscoop besturingssoftware. Controleer of alle fase posities zijn nog steeds in de focus op latere punten. Voor time-lapse experimenten die over enkele uren, we af en toe waarnemen een podium drift zelfs bij gebruik van autofocus. Als het podium posities moeten worden geheroriënteerd, stoppen met het experiment op een geschikt tijdstip, de scherpstelling aan te passen en het experiment binnen de gedefinieerde beeldvorming tijdsinterval (stap 3.7.3) opnieuw op te starten. Zie stap 4.3 voor informatie over het samenvoegen van de tijdreeks. Stops Image overname na 24-30 uur of wanneer de schimmeldraden in de regio van belang in de sporen hebben onderscheiden (zie DIC afbeelding serie). Stop stroom programma in de software en demonteer de microfluïdische apparaat. Bereid gebruikte microfluïdische plaat voor de korte termijn stowoede. Verwijder de resterende MYM-TE en bracht MYM-TE uit goed 1-6, lege afval goed 7 en mobiele laad- en 8. Onder steriele omstandigheden, re-fill gebruikt putjes van lane "A" en putjes van ongebruikte lanes ( "B" aan "D") van de plaat met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Seal de plaat met parafilm om te voorkomen dat het uitdroogt en bewaar bij 4 ° C. 4. Generation of Time-lapse films met behulp van Fiji Software Let op: We merken op dat verschillende commerciële en gratis software-pakketten zijn beschikbaar voor time-lapse microscopie beelden waaronder ZenBlue, Metamorph, ICY, ImagePro of ImageJ verwerken. Hier richten we ons op Fiji, dat is een open-source beeldverwerking programma op basis van ImageJ, en die reeds voorziet in een aantal nuttige vooraf geïnstalleerde plugins. Transfer beeldgegevens van uw time-lapse experiment om een computer die Fiji heeft geïnstalleerd. Lanceren programma en importeer de imaging-bestand met behulp van &# 34; Bestand> Importeren> Bio-Formats ". Of gewoon door de imaging-bestand te slepen in Fiji In de" Bio-Formats Import Options ", vinkt u het vakje" split kanalen "naar een afzonderlijk beeld stapel voor elk verlichting kanaal te verkrijgen (DIC , RFP, YFP). Optioneel: Als u samenvoegen gescheiden time-series als gevolg van een breuk in de in het beeld overname als gevolg van heroriëntatie (stap 3.9), opent respectieve afbeelding stacks en run "Beeld> Stapels> Extra> Aaneenschakelen" voor elk kanaal (DIC, RFP, YFP ). Beoordelen van de kwaliteit van de time-lapse-gegevens door te bladeren door het beeld stacks. Kijk voor schimmeldraden die na verloop van tijd verbleef in focus, tonen mycelium groei en uiteindelijk vormen sporen (DIC stack). Onderzoek de verwachte subcellulaire lokalisatie voor DivIVA-mCherry bij hyphal tips (RFP stack) en FtsZ-YPet vormende enkele ringen of meerdere, ladder-achtige structuren in vegetatieve of sporogene schimmeldraden (YFP stack), respectievelijk. Isoleer een regio van belang voor downstream processusng van de beelden. Time-lapse microscopie levert vaak grote bestanden die kunnen vertragen verwerking door Fiji. Het wordt daarom aanbevolen te identificeren en isoleren van een regio van belang (ROI) en verdere beeldverwerking stappen uit te voeren op deze kleinere versie van de afbeelding stapel. Selecteer de "Rectangular Selection" tool in het menu en teken een rechthoekige ROI in de DIC afbeelding stapel op een zodanige wijze dat de ontwikkelingslanden hyfen worden omsloten door de ROI in de gehele afbeelding serie. Dupliceren ROI-stack met 'Ctrl' + 'Shift' + 'D'. Klik op de naam bar van het YFP afbeeldingsstapel en selecteer "Bewerken> Selectie> Restore Selection 'in het menu om de vorige rechthoekige selectie uit de oorspronkelijke DIC herstellen stapelen op dezelfde positon in de YFP stack en dupliceren de ROI met" Ctrl " + "Shift" + "D". Herhaal dit proces voor de RFP stack. Lijn de beelden in de drie stapels to verwijderen stadium afwijkingen in het xy-vlak na verloop van tijd. Ga naar het laatste frame in de DIC stack en selecteer "Plugin> Registratie> StackReg> RigedBody" in het menu. Herhaal deze stap voor de RFP en de YFP afbeelding stapel. Indien nodig, bij te snijden de ROI door het herhalen van stap 4.5.1-4.5.3. Optioneel: helderheid en het contrast handmatig aanpassen voor elk beeld stack met de "Aanpassen Helderheid en contrast Tool" ( "Ctrl" + "Shift" + "C") of selecteer "Proces> Enhance Contrast" in het menu en breng het "normaliseren" commando om alle afbeeldingen in de stack. Opgemerkt zij dat deze opdracht zal pixelwaarden wijzigen, waardoor stroomafwaarts beeldanalyse beïnvloeden. Optioneel: Combineer individuele stapels (omgerekend naar de RGB-bestandsindeling, zie 4.11) horizontaal of verticaal met behulp van de plugin "Beeld> Stapels> Extra> Combineren". Voeg een schaal bar ( "Analyze> Extra> Scale Bar") en een tijd stempel (&# 34; Afbeelding> Stacks> Time Stamper "). Bewaar gewijzigde afbeelding stacks als een reeks afbeeldingen in de ".tiff" formaat. Om een film te produceren, opslaan als ".avi". Als alternatief beeld export serie in het QuickTime-formaat met behulp van de "Bio-Formats> Bio-Formats exporteur" plug-in en selecteer de ".mov" bestandstype. Als u foto's van de afzonderlijke frames te verkrijgen, selecteert u het kader van de rente en dupliceren het beeld 'Ctrl' + 'Shift' + 'D'. Wijzig het type van het resulterende beeld op "RGB" of "8-bit" onder "Beeld> Type> RGB-kleur of 8-bit" en sla de afbeelding als ".tiff". Opmerking: Fiji biedt een aantal extra functies om verder te annoteren of proces time-lapse-serie. Ga naar Fiji online ondersteuning voor meer informatie (http://fiji.sc/Fiji).

Representative Results

De succesvolle levende cellen beeldvorming van het gehele S. venezuelae levenscyclus levert een continue tijd-serie, waaronder de belangrijkste ontwikkelingsstadia van de kieming, vegetatieve groei en sporulatie (Figuur 3, Movie 1). Visualisatie van het doorlopen van de levenscyclus wordt verder versterkt door de verschillende subcellulaire lokalisatie van DivIVA-mCherry en FtsZ-YPet. Bij het ontkiemen en vegetatieve groei, DivIVA-mCherry hoopt zich exclusief op de groeiende hyphal tips of merken nieuw gevormde tak punten (Figuur 4A). Deze resultaten zijn in lijn met de eerder gerapporteerde subcellulaire positionering van DivIVA 12,26. In tegenstelling FtsZ-YPet vormt enkele ring-achtige structuren met onregelmatige tussenpozen in de groeiende mycelium (Figuur 4B). Deze structuren de matrix voor de synthese van niet-constrictieve vegetatieve dwarswanden, leidt tot de vorming van interconnweerspiegelde hyphal compartimenten 8. De cellulaire differentiatie van groeiende hyfen in sporogene hyfen zichtbaar door het verdwijnen van polaire DivIVA-mCherry foci, de arrestatie van polaire groei en de gelijktijdige toename van FtsZ-YPet fluorescentie (Figuur 4C). In sporulerend hyfen, de lokalisatie patroon van FtsZ-YPet drastisch verandert; eerste spiraalvormige FtsZ-YPet filamenten tuimelen langs de schimmeldraad en daarna, in een plotselinge, bijna synchroon geval zijn deze helices samenvloeien tot een ladder van regelmatige afstanden FtsZ-YPet ringen. Met de hier beschreven experimentele condities, die gelijkmatig verdeeld FtsZ-YPet ladders aanhouden ongeveer 2 uur. Tot slot, sporulatie septa worden waarneembaar in het differentieel interferentie contrast (DIC) beelden (figuur 4D) en eventueel nieuwe sporen worden vrijgegeven. De daarop volgende protocol beschrijft de beeldverwerking met behulp van de software Fiji bepaalt TEP-voor-stap uitgelegd hoe je een film te produceren voor de publicatie van de verworven time-lapse-serie (Film 1). Figuur 3: Snapshot beelden van een representatieve time-lapse fluorescentiemicroscopie reeks van S. venezuelae produceren fluorescent gelabelde FtsZ (groen) en DivIVA (Rood) Getoond worden de geselecteerde frames van samengevoegde beelden (bovenste paneel: RFP-YFP-DIC, onderste paneel: DIC). visualiseren van de Streptomyces levenscyclus inclusief ontkieming, vegetatieve groei en sporulatie. Beelden werden genomen van Movie 1. Tijd is in uur: min. Schaal bars = 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. d / 53863 / 53863fig4.jpg "/> Figuur 4: Representatieve resultaten voor een succesvolle time-lapse-reeks van het Streptomyces levenscyclus (A) lokalisatie van DivIVA-mCherry.. Getoond zijn momentopnamen van twee opeenvolgende tijdstippen van Movie 1 met samengevoegde beelden van de RFP en DIC kanalen. DivIVA-mCherry markeert nieuwe hyphal filialen (gevulde pijlpunt) en lokaliseert op de hyphal tip om polaire groei (open pijlpunt) te sturen. Schaal bar = 10 micrometer (B) FtsZ-YPet lokalisatie tijdens de vegetatieve groei (pijlpunt). FtsZ-YPet vormt enkele ring-achtige structuren (bovenste paneel) die niet vernauwen (DIC, onderste paneel). (C) FtsZ-YPet (groen) lokalisatie tijdens sporulatie septation. DivIVA-mCherry brandpunten worden weergegeven in het rood, met de verstreken tijd hieronder weergegeven (uur: min). Schaal bar: 5 micrometer. (D) Overeenkomstige DIC beelden van de sporulerende schimmeldraden van (C) met de vormatie van prespore compartimenten met zichtbare sporulatie septa (afbeelding links), die uiteindelijk uitgroeien tot een keten van sporen (afbeelding rechts). Tijd is in uur: min. Schaal bar = 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Film 1: Time-lapse fluorescentie microscopie-serie van het Streptomyces venezuelae levenscyclus De film bestaat uit samengevoegde RFP-YFP beelden (links) en de bijbehorende differentieel interferentie contrast (DIC) foto's (rechts).. DivIVA-mCherry wordt getoond in rood en FtsZ-YPet in het groen. Het tijdsinterval tussen de afzonderlijke frames is 40 min. Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om thi te bekijkens film.

Discussion

Time-lapse microscopie van de Streptomyces levenscyclus is technisch uitdagend in het verleden. Hier presenteren we een robuust protocol live-cell imaging van de volledige levenscyclus met fluorescerende eiwit fusies aan de cel polariteitsmarkering DivIVA en de celdeling eiwit FtsZ om visualiseren en sporen doorlopen van het ontwikkelingsprogramma (figuur 2) voert.

Centraal in deze werkwijze is het kweken van S. venezuelae in een microfluïdische apparaat dat constant medium perfusie en de uitwisseling van de normale groeimedium (MYM-TE) met verbruikte medium (doorgebracht MYM-TE) mogelijk maakt. De verandering van kweekomstandigheid is belangrijk voor de beschreven protocol omdat de voeding terugschakelen als putten als elk ongeïdentificeerde extracellulaire signalen (bijv quorum sensing signalen) in het verbruikte kweekmedium bevorderen sporulatie, terwijl een continue aanvoer van voedselrijk medium stimuleert vegetatieve growth met weinig vorming van sporen (gegevens niet getoond). Aldus kweken van cellen in deze microfluïdische systeem is superieur aan kweken van cellen op agarose omdat het meer experimentele flexibiliteit en maakt continu monitoren van veranderingen in bacteriegroei in reactie op veranderende kweekomstandigheden. Alleen al de microfluïdische platen zijn ontworpen voor eenmalig gebruik, stromingskanalen die niet zijn geënt met cellen kan worden gebruikt in daaropvolgende experimenten. Wij raden u aan alle kanalen van een microfluïdische plaat binnen een week, omdat we problemen afdichten van de manifold om platen die voor langere tijd hebben geopend hebben meegemaakt.

Bij het opzetten van een experiment, vonden we dat vers bereide sporen ontkiemd binnen twee uur van in de stromingskamer geladen, terwijl sporen verkregen uit een bevroren glycerol vereist ten minste 6 uur voor kiembuisjes ontstaan (gegevens niet getoond). Deze vertraging in kieming verlengt de duur van het experiment en kan verstorenuitrusting beschikbaarheid en de experimentele omstandigheden. Het is ook belangrijk om het experiment met perfusie van MYM-TE starten minstens 3 uur voldoende voedingsstoffen voor de ontwikkeling en uitgroei van kiembuisjes verschaffen. Perfusie met MYM-TE kan worden verlengd tot na de eerste 3 uur als het experiment is bedoeld om de vegetatieve groei te bestuderen. Terwijl sporen bieden de voorkeur van uitgangsmateriaal, kan korte hyfale fragmenten ook worden geladen in de microfluïdische plaat. Echter, het laden efficiency bij het gebruik geschoren mycelium is significant lager en vereist vaak meerdere laden runs waarin een beperking kunnen opleveren bij de behandeling van niet-sporulerende mutanten. Ongeacht het type inoculum gebruikt, is het belangrijk de kweekkamer met sporen of hyphen fragmenten dit niet te overbelasten leidt tot snelle overbevolking die kunnen interfereren met media diffusie en bemoeilijken beeldanalyse.

Het is belangrijk om de constructie van reporter eiwitten plannen carefully voor gebruik in fluorescentie time-lapse imaging in Streptomyces. Linkerlengte tussen het doeleiwit en de fluorescente reporter en de keuze van de N- of C-terminale fusies kan kritisch. Bovendien optimale experimentele condities, waaronder imaging frequentie en de belichtingstijd, moeten van tevoren worden bepaald voor elke fluorescent-gelabelde eiwitten. S. venezuelae schimmeldraden vertonen auto-fluorescentie in de groen / geel-kanaal dat problematisch kan worden wanneer het afbeelden van een fluorescent gelabeld eiwit dat tot expressie wordt gebracht op een laag niveau. Voorts zij opgemerkt dat tijdens het ontkiemen en de eerste vegetatieve groeifase, S. venezuelae is bijzonder gevoelig voor de korte golflengte (bijvoorbeeld bij gebruik van eiwit fusies aan GVB).

Ondanks de voortdurende vooruitgang in de beeldvormende technieken en fluorescerende reporter systemen voor live cell imaging van bacteriën, de meeste van de softwarepakketten (bijv MicrobeTracker, Schnitzelcells, CellProfiler) voor de volgende geautomatiseerde verwerking van dit soort data sets geen ondersteuning voor de analyse van de beelden afkomstig zijn van draadvormige bacteriën met een meercellig leven stijl ^27-29. Er is dus een noodzaak om een geschikt algoritme voor de kwantitatieve high-throughput analyse van beeldgegevens van Streptomyces en andere filamenteuze bacteriën ontwikkelen.

Kortom, het hier beschreven werk toont het immense potentieel van S. venezuelae als nieuwe vorm ontwikkelingssysteem voor het geslacht, vanwege zijn vermogen om sporulatie in vloeistof. De microfluïdische kweken apparaat is eenvoudig te gebruiken, zelfs voor onervaren gebruikers. Het biedt een uitstekend platform om celbiologische processen centraal in het Streptomyces levenscyclus, inclusief dynamische eiwit lokalisatie, gepolariseerd groei, en de morfologische differentiatie van een meercellige mycelium in ketens van unigenomic sporen te bestuderen. Daarnaast stellen deze experimentele up ook een aantrekkelijk uitgangspunt om gebeurtenissen in de ontwikkeling die vereisen afwisselend kweekomstandigheden, of het gebruik van fluorescerende kleurstoffen zoals fluorescente D-aminozuren aan peptidoglycan synthese of propidiumjodide en 4 monitoren ', 6-diamidino-2-fenylindol onderzoeken (DAPI) chromosoom organisatie ^30,31 visualiseren.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Grant Calder for technical assistance with the microscope, Matt Bush for comments on the protocol, and the John Innes Centre for purchase of the Zeiss widefield microscope. This work was funded by BBSRC grant BB/I002197/1 (to M.J.B), by BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 to the John Innes Centre, by Swedish Research Council grant 621-2010-4463 (to K.F.), and by a Leopoldina Postdoctoral Fellowship (to S.S.).

Materials

B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells	Merck-Millipore	B04A-03-5PK	Microfluidic culture plates
CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2)	Merck-Millipore	EV-262	The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss	431007-9902-000	Fully automated and motorized inverted widefield microscope
Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2	Zeiss	411857-9061-000	Environmental chamber surrounding the microscope
Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective	Zeiss	420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2	Hamamatsu Photonics K.K.	C11440-22CU
Illuminator HXP 120V	Zeiss	423013-9010-000
FL Filter Set 46 HE YFP shift free	Zeiss	489046-9901-000	Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm
FL Filter Set 63 HE RFP shift free	Zeiss	489063-0000-000	Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm
Mounting frame K-M for multiwell plates	Zeiss	000000-1272-644	Stage holder for microfluidic plate
ZEN pro 2012	Zeiss	410135-1002-120	Microscope control software
ZEN Module Time Lapse	Zeiss	410136-1031-110	Software module to set up time-lapse microscopy experiments
ZEN Module Tiles/Positions	Zeiss	410136-1025-110	Software module to save specific stage positions (xzy)
Fiji	open-source software package	http://fiji.sc/Fiji	Generation of time-lapse movies
Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM) 4 g Maltose 4 g Yeast extract 10 g Malt extract add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving			Sporulation medium used to culture S. venezuelae SV60
R2 Trace element solution (TE) 8 mg ZnCl₂ 40 mg FeCl₃-6H₂O 2 mg CuCl₂-2H₂O 2 mg MnCl₂-4H₂O 2 mg Na₂B₄O₇-10H₂O 2 mg (NH₄)₆Mo₇O₂₄-4H₂O add 200 ml H₂O Autoclave and store at 4 ^oC			Add 0.002 volumes to MYM
PBS (phosphate buffered saline)	Sigma	P4417-100TAB	Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage.
0.22 µm syringe filters	Satorius stedim	16532-K	Preparation of spent MYM-TE
SV60	John Innes Centre strain collection		S. venezuelae strain expressing divIVA-mcherry and ftsZ-ypet

Referenzen

Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in streptomycetes. Nat. Rev. Microbiol. 13, 749-760 (2015).
Jakimowicz, D., van Wezel, G. P. Cell division and DNA segregation in Streptomyces.: how to build a septum in the middle of nowhere?. Mol. Microbiol. 85, 393-404 (2012).
McCormick, J. R., Flärdh, K. Signals and regulators that govern Streptomyces development. FEMS Microbiol. Rev. 36, 206-231 (2012).
Flärdh, K., Richards, D. M., Hempel, A. M., Howard, M., Buttner, M. J. Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces. Curr. Opin. Microbiol. 15, 737-743 (2012).
Hempel, A. M., et al. The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 109, E2371-E2379 (2012).
Fuchino, K., et al. Dynamic gradients of an intermediate filament-like cytoskeleton are recruited by a polarity landmark during apical growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E1889-E1897 (2013).
Holmes, N. A., et al. Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E397-E406 (2013).
McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. Growth and viability of Streptomyces coelicolor. mutant for the cell division gene ftsZ. Mol. Microbiol. 14, 243-254 (1994).
Margolin, W. FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 862-871 (2005).
Grantcharova, N., Lustig, U., Flärdh, K. Dynamics of FtsZ assembly during sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 187, 3227-3237 (2005).
Richards, D. M., Hempel, A. M., Flärdh, K., Buttner, M. J., Howard, M. Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria. PLoS Comput. Biol. 8, e1002423 (2012).
Hempel, A. M., Wang, S. B., Letek, M., Gil, J. A., Flärdh, K. Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 190, 7579-7583 (2008).
Wolanski, M., et al. Replisome trafficking in growing vegetative hyphae of Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 193, 1273-1275 (2011).
Jyothikumar, V., Tilley, E. J., Wali, R., Herron, P. R. Time-lapse microscopy of Streptomyces coelicolor.growth and sporulation. Appl. Environ. Microbiol. 74, 6774-6781 (2008).
Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T., van Wezel, G. P. Positive control of cell division: FtsZ is recruited by SsgB during sporulation of Streptomyces. Genes. Dev. 25, 89-99 (2011).
Glazebrook, M. A., Doull, J. L., Stuttard, C., Vining, L. C. Sporulation of Streptomyces venezuelae. in submerged cultures. J. Gen. Microbiol. 136, 581-588 (1990).
Bibb, M. J., Domonkos, A., Chandra, G., Buttner, M. J. Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins in Streptomyces venezuelae.is controlled by sigma(BldN) and a cognate anti-sigma factor, RsbN. Mol. Microbiol. 84, 1033-1049 (2012).
Al-Bassam, M. M., Bibb, M. J., Bush, M. J., Chandra, G., Buttner, M. J. Response regulator heterodimer formation controls a key stage in Streptomyces development. PLoS Genet. 10, e1004554 (2014).
Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. MBio. 4, e00684-e00613 (2013).
Tschowri, N., et al. Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development. Cell. 158, 1136-1147 (2014).
Mirouze, N., Ferret, C., Yao, Z., Chastanet, A., Carballido-Lòpez, R. MreB-Dependent Inhibition of Cell Elongation during the Escape from Competence in Bacillus subtilis. PLoS Genet. 11, e1005299 (2015).
Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using GRAFTS. J. Vis. Exp. (e50456), (2013).
Meniche, X., et al. Subpolar addition of new cell wall is directed by DivIVA in mycobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, E3243-E3251 (2014).
Donovan, C., Schauss, A., Kramer, R., Bramkamp, M. Chromosome segregation impacts on cell growth and division site selection in Corynebacterium glutamicum. PLoS One. 8, e55078 (2013).
Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. Response of Escherichia coli. growth rate to osmotic shock. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, 7807-7812 (2014).
Flärdh, K. Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2). Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).
Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).
Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).
Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).
Szafran, M., et al. Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation. J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Diesen Artikel zitieren

Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (108), e53863, doi:10.3791/53863 (2016).