Monitoramento óptico do nervo Viver Terminal Etiquetagem na folículo piloso Lanceolate Endings da<em> Ex Vivo</em> Mouse pele da orelha

Estes métodos foram utilizados na pesquisa, publicada em Bancos, RW et ai. 2 Os ratos foram humanamente eutanasiados por deslocamento cervical. No Reino Unido, esta é uma Anexo 1 método legalmente aprovado listado nas Animais (Scientific Procedures) Act de 1986 e da Directiva Europeia 2010/63 / UE. Esta legislação federal é aplicada localmente na Universidade de Aberdeen pelo Bem-Estar Animal e Ethical Review Board, que aprovaram todos os procedimentos. 1. Orelhas preparando para Labeling Prepara-se uma solução salina fisiológica convencional, tal como de Liley (1956) 5 e satura com 90% de O2 / 5% de CO 2 (carbogénio). Solução salina de Liley é (mM): NaHCO3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl2 (1), CaCl2 (2) e glicose (11). NOTA: Durante o resto deste manuscrito, "salina" irá referir-se a solução salina que está totalmente saturado com carbogênio. durante dissection, atualizar a solução salina cobrindo a preparação a cada 15 – 20 min. Humanamente sacrificá um rato adulto sem danificar o crânio. NOTA: Nós usamos ratos C57 / Bl6J e MF1, mas qualquer tensão mouse pode ser usado. O aspecto mais importante é não usar grandes adultos (> 25 g). Rotulagem em camundongos maiores é menos confiável, sendo muitas vezes confinados a pequenas e dispersas grupos de folículos. Retire as orelhas externas (pavilhões auriculares) perto da base com ~ 25 cm tesoura, logo acima da linha do cabelo denso, e mergulhe em solução salina em um silicone revestido de borracha cultura / placa de Petri (50 mm são geralmente conveniente). Posição anterior lateral (côncava) o pavilhão auricular para baixo e fixar as margens para o silicone em intervalos regulares com pinos finos de insectos (~ 6 – 8 por orelha, ~ 0,2 mm de diâmetro pinos). Atualizar salina a cada 15 – 20 minutos, ou usar um banho constantemente perfundidos. Retire cuidadosamente afastado a pele posterior da pele anterior por dissecção romba, inicialmente aceder a partir da base de corte da orelha sobrea cartilagem central grosso e sistematicamente a trabalhar para as margens externas finas, livre de cartilagem. Para fazer isso, mantenha o centro da aresta de corte da pele posterior com um par de nenhuma. 3 fórceps. Em seguida, com as mandíbulas fechadas, colocar os pontos de um outro conjunto de nenhuma. 3 fórceps no espaço entre a pele ea cartilagem subjacente. Suavemente trabalhar os pontos de pinça fechadas a partir de lado-a-lado no interior da abertura, por meio da força mínima necessária, cuidadosamente solte enquanto aderências descascar a pele posterior a separar as camadas. Com a pele posterior removida, deixar a pele anterior em posição. Pin a pele posterior, o lado dérmico-se, ao lado da pele anterior (conforme 1.5, acima). Em seguida, cuidadosamente e remover completamente a cartilagem do pavilhão que foi ensanduichada entre as camadas da pele a partir da pele anterior pela mesma técnica de dissecção romba como em 1.6. Evitar fazer furos com a pinça. Em seguida, fou ambas as preparações para a pele delicadamente Pinna casca, coragem e esfregar a fina camada de tecido conjuntivo, assemelhando-se espuma de poliestireno expandido, que cobre as bases do folículo piloso. NOTA: A obtenção de compensação ideal pode demorar um pouco de prática; remoção insuficiente de tecido obstrui o acesso, tanto para a solução de corante e para geração de imagens, enquanto raspagem demasiado vigorosa remove as redes neurais, que estão na base dos folículos. Atualizar a solução salina. Rotulagem 2. Lanceolate Terminal NOTA: O seguinte protocolo é otimizado para corante de estirilo piridínio. Outros, quimicamente semelhantes, corantes pirid�nio estirilo deve funcionar, talvez depois de algum ajuste na concentração e tempo de incubação. Use luvas e uma bata de laboratório ao manusear soluções de corantes. Ou comprar solução de corante 10 mM diretamente do fabricante ou preparar estoque dissolvendo o pó de corante em solução salina sem glicose. Alíquota (10 mL é geralmente conveniente, mas ajustar isso para a grande scale experimentos) e armazene congelado por até 6 meses a -20 ° C ou ~ 1 ano a -80 ° C. Pó irá armazenar durante pelo menos 2 anos. Evite congelamento repetido / descongelamento de soluções de corantes; este desnatura-se rapidamente o corante. Uma vez descongelado, armazenar a 4 ° C e usar dentro de uma semana. Pré-aquecer num banho de água a 30 ° C, com uma plataforma de ~ 3-5 mm abaixo da superfície da água. Recém preparar 10 mM solução estiril piridínio corante (10 ul de corante de estirilo piridínio 10 mM recém-descongelado em 10 ml de solução salina) e equilibrar em banho-maria. Pin cada preparação de um silicone de borracha forrada 35 mm de placas de cultura submersa em 1 – 2 mm de solução salina (volume típico, ~ 2 ml). Cada preparação da pele do pavilhão auricular irá produzir duas preparações se cortar pela metade a partir do vértice à base com uma tesoura pequena (10 – 15 cm de comprimento), para minimizar a utilização de animais. Colocar as cápsulas de 35 mm contendo as preparações Pinna coberta com solução salina na plataforma submersa no 30 ° C banho-maria. garantir aa profundidade da água é suficiente para o aquecimento adequado, mas não contamina a solução salina no prato aberto. Bem Pin (0,5 – diâmetro exterior 1 mm) tubulação com fluxo O 2 / CO 2 para a base de silicone de cada prato para o gás de forma contínua os preparativos. Também coloque em banho-maria 100 ml de solução salina livre de corante para refrescante lavagem / prato. Use uma garrafa com rolha firmemente para manter a saturação carbogênio e prevenir a contaminação da água. Equilibrar tudo a 30 ° C durante 30 min e depois substituir a solução salina sobre as preparações de Pinna os 100 ml recipiente rolhado. Incubar mais 30 minutos. NOTA: Esta substituição compensa a evaporação de solução salina e quaisquer perdas de volume em massa resultantes da linha de gás borbulhante. Deite fora salina livre de corante em um 100 ml copo de resíduos, em seguida, rapidamente e cuidadosamente apagar afastado qualquer líquido restante em torno da preparação com papel de seda para minimizar os efeitos de diluição na solução de corante para ser adicionado ao lado. Tome cuidado para não tocar ( <em> ou seja, danos) as superfícies dérmicas profundas expostas diretamente. Incubar preparações Pinna em 2 – 3 ml de 10 uM de corante de estirilo piridinio durante 40 min a 30 ° C, em seguida, voltar para o R / T para o resto do procedimento. Remover o corante não-internalizado em três etapas, usando soluções em R / T. NOTA: Estes passos são melhor realizadas em luz mínima ambiente (persianas, vermelho / laranja iluminação baixa intensidade) para começar a olho escuro-adaptação para a imagem latente. Deite fora a solução de rotulagem dos pratos em um copo de resíduos e rapidamente enxaguar em três mudas de solução salina livre de corante em rápida sucessão. Isto remove a solução de corante de estirilo piridínio residual aderente às preparações e qualquer corante que facilmente departitions a partir de membranas expostas. Incubar numa mudança final de solução salina livre de corante durante mais 30 min para departition corante mais restante a partir de membranas de superfície, isto é, não corante internalizado pelos terminais. Remover corante persistente preso tO folheto externa das membranas expostas por quelação com o derivado sulfonado b-ciclodextrina (ADVASEP-7, 1 mM, 5 min – ver Tabela 1). Assim, todos os restantes corante estará dentro dos tecidos. Colocar em solução salina livre de corante fresco para imagiologia e secar o exterior do prato cuidadosamente com papel de seda. NOTA: Os terminais estão agora prontos para a imagem latente. É importante estar ciente de que as terminações lanceoladas estão vivos e, portanto, liberando lentamente o corante piridínio estiril endocitado novamente. Embora esta será mais lenta em R / T, é importante para minimizar os atrasos antes / durante a imagem. Se a experiência exige a rotulagem de várias preparações, inicialmente manter todos eles não marcado a 30 ° C. Eles vão ser viável por várias horas. Em seguida, rotular sequencialmente em intervalos, ao rotular o segundo preparação (passos 2.7 – 2.8.3), enquanto imagem da primeira. 3. Imagem Rotulado Lanceolate Endings. NOTA: O observadordeve ser escuro-adaptado para as seguintes etapas de imagem. O aumento da acuidade visual este proporciona significa que os níveis mais baixos de luz de excitação são necessários para encontrar os folículos para a imagem latente. Isso é mais importante para minimizar fototoxicidade em vez de reduzir a inconveniência de fotodegradação. Os radicais livres gerados pela iluminação intensidade total pode rapidamente (dentro de 60 seg) matar vivendo terminais nervosos (GS Bewick, S. Fadul e WJ Betz, observações não publicadas). Antes de imagem, verifique a preparação sob um microscópio estereoscópico de dissecação e remova cuidadosamente quaisquer detritos superfície. Isto impede a auto-fluorescência contaminando as imagens. Monte o prato no palco de um microscópio de epifluorescência na posição vertical com um conjunto de filtros de fluoresceína padrão (480-488 nm de excitação, 500-520 nm de emissão para estiril corante piridínio). Atenuar a intensidade da luz de excitação com filtros de densidade neutros até que apenas o suficiente para localizar o terminal confortavelmentes. Localize folículos rotulados, observando com baixa (3,5x – 4x objetivo seco), em seguida, progressivamente objetivos maiores (objetiva de imersão 10x e 20x de água) de ampliação. Capturar imagens de terminais lanceoladas marcados através de 10x objetivo seco para baixa potência e 20x objetivos de imersão em água para maior ampliação. Minimizar a luz intensidade e tempo de exposição (a tempo de integração da câmera de 0,5 – é sugerido 1 seg). Capturar imagens em uma câmera digital padrão e salvar imagens no disco rígido do computador utilizando o software proprietário. NOTA: Um exemplo típico é mostrado na Figura 1. Imagem ~ 20 terminações lanceoladas de cada preparação. Comece pelo mais distante margem a partir da borda corte na base da pele do pavilhão auricular e do trabalho ao longo desta margem de imagiologia cada folículo, por sua vez. Trabalhar transversalmente em ligeiramente sobrepostos campos paralela à borda do corte, tomando cuidado para não imagem do mesmo folículo duas vezes e as que são, obviamente, danificado. Note ore são tipicamente muitos terminais lanceoladas a imagem todos eles antes significativa espontânea de-coloração ocorre. Assim, sugerimos que sistematicamente amostragem da população usando o seguinte protocolo. Depois de completar a tira marginal, mover um campo de largura em direcção à base do pavilhão, e repetir o processo no sentido inverso. Imagem todos os terminais encontrou, exceto os ocasionais claramente orientados muito mais obliquamente ao plano óptico e improvável para caber inteiramente dentro do ROI análise anular padrão (ver secção 4). Não excluem lanceolates excepcionalmente brilhantes ou dimmer em comparação com os terminais vizinhos, a menos que eles são, obviamente, danificado ou intensidade fundo é particularmente elevado, indicando dano tecidual localizada. Descartar a preparação, se mais do que 10% da área de pele / terminais estão danificados / inutilizável. NOTA: Como lanceolates Destain com o tempo, a imagem completa de cada preparação dentro de 20 minutos do final da lavagem. Euf usando mais de uma preparação, garantir comparações intensidade são válidos por preparações de correspondência de tempo. Para fazer isso, compensar horários de coloração cada preparação por ~ 30 min, para assegurar a comparabilidade dos tempos de-mancha. Para monitorar de-mancha (exocitose), a imagem do mesmo terminal em intervalos de 5 ou 10 min. Com a prática, é possível para a imagem até 3 terminais separados em cada ponto no tempo em qualquer uma preparação. 4. Análise Rotulado Lanceolate Endings. Nota: O procedimento que se segue é um método rápido para analisar a intensidade do terminal. Realizar uma região anelar de interesse (ROI) centrado na ponta do eixo do cabelo na base do folículo (Figura 2). Definir a circunferência interna do ROI anular grande o suficiente para evitar o eixo do cabelo auto-fluorescência em qualquer folículo a ser analisado, mas ainda abranger toda a fluorescência do terminal. Certifique-se que a circunferência externa é grande o suficiente para envolver o maior terminai que poderão ser encontrados que está orientada para próximo do eixo óptico / folículo principal. Adicione uma ROI fundo aproximadamente igual em área alvo para o anel tubular (quadrado ou círculo, tipicamente ~ 400? M 2) para determinar a intensidade da coloração local, na vizinhança do terminal em análise. Nota: Os tamanhos destes dois ROIs são definidas no início da análise e utilizado para analisar todos os folículos / terminais lanceoladas subsequentes em todas as preparações em qualquer experiência. Então, é importante para definir os seus parâmetros com cuidado no início. Coloque o ROI de fundo perto o suficiente para o folículo para representar fundo local nas glândulas sebáceas que estão na base dos terminais, não a pele menor intensidade entre os folículos, mas tome cuidado para não incluir quaisquer regiões terminais. Grave a intensidade média das duas ROIs usando o 'medida' ou 'analisar ROI' função do software e transferência de dados para uma planilha. Na planilha, para cada folículo indivíduo subtrair o local de intensidade média de fundo do que no anel para dar uma intensidade líquida. Este ajustamento para o fundo localizada reduz bastante variabilidade entre folículo.