Optische Überwachung der Lebensnervenendigung Beschriften in Haarfollikel Lanceolate Endigungen der<em> Ex Vivo</em> Maus-Ohr-Haut
Summary
Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.
Abstract
Eine neuartige Dissektion und Aufzeichnungstechnik wird zur optischen Überwachung Färbung und de-Färbung von lanceolate Terminals umgebenden Haarfollikel in der Haut der Ohrmuschel der Maus beschrieben. Die Herstellung ist einfach und relativ schnell, zuverlässig umfangreiche Regionen von mehreren markierten Einheiten von lebenden Nervenendigungen Nachgeben extensiv in Studien der Vesikelrecycling verwendet zu untersuchen Aufnahme und Abgabe von Styryl pyridinium-Farbstoffe. Unterteilen der Vorbereitungen vor der Markierung ermöglicht Test vs. Kontrolle Vergleiche im gleichen Ohr von einem einzelnen Individuum. Hilfreiche Tipps für die Verbesserung der Qualität der Zubereitung, die Kennzeichnung und die Abbildungsparameter gegeben. Dieses neue System ist geeignet für pharmakologisch Untersuchung und mechanisch induzierte Aufnahme und Freisetzung dieser Vitalfarbstoffe in lanceolate Terminals sowohl in Wildtyp und gentechnisch veränderte Tiere. Beispiele für modulierende Einflüsse auf die Markierungsintensität gegeben.
Introduction
Mechanosensorischen Nervenenden sind in der Regel klein, diffus verteilt und schwer zugänglichen in situ, da sie in der Regel tief in die Haut oder andere umgebende Gewebe eingebettet sind. Visualisieren sie daher durch eine verlängerte Immunmarkierung / Färbungszeit oder die Verzögerung und die Kosten des Erhaltens Mauslinien mit genetischen Expression von Fluoreszenzmarkierungen, wie grün oder gelb fluoreszierende Protein (GFP / YFP) 1 gefolgt erfordert in der Regel sectioning. Hier zeigen wir eine bequeme Gewebe und eine schnelle und einfache Methode , den Zugang zu einer großen Anzahl von Haarfollikel Afferenzen für das Studium zu gewinnen, und wie sie schnell zur optischen Überwachung von Terminal – Funktion 2 markiert werden. Mit etwas Übung kann die gesamte Technik von Dissektion Bildgebung in weniger als 2 Stunden abgeschlossen sein.
Die lanceolate Terminals sensorischer Axone innervieren Haarfollikel in Säugetieren Palisaden um das Epithel der Haarbalg bilden, mit jeweilsKlemme zwischen Glia / Schwann – Zellen sandwichartig verarbeitet 2-4. Der Zweck der Klemmen ist die mechanische Verschiebung der Haare zu erfassen, sie umgeben. Sie sind eine Mischung von schnell und langsam Anpassung Enden, aber sie produzieren überwiegend kurze Ausbrüche von Aktivität in Reaktion auf Haarbewegung. Typischerweise stoppt die Zündung sehr schnell, wenn die Bewegung aufhört, auch in Gegenwart von fort Verschiebung.
Dieses murine Ohrmuschel Modell für die Untersuchung lanceolate Terminals durch optische Verfahren hat viele vorteilhafte Merkmale für die Struktur und Funktion dieser Digungen studieren. Die Ohrmuschel ist vorwiegend zwei Schichten der Haut angelagert back-to-back, mit nur einer geringen Menge von Knorpelgewebe dazwischen. Die Haut ist sehr dünn und leicht durch minimale Mengen von Klebstoff schwach Bindegewebe relativ zu anderen Regionen des Körpers präpariert. Die leicht getrennt Hautschichten, daher geben einen guten Zugang zu den Follikeln und Terminals. Die Innervationleicht zugänglich und erkennbar ist. Die Haarfollikel mehr sind spärlich verteilt als in anderen Hautregionen, die Abbildung einzelner oder kleiner Gruppen von Follikeln zu erleichtern. Die dünne darunter liegende Hautschicht ergibt eine gute Zugänglichkeit zu Farbstoffe und pharmakologische Medikamente, so ist ideal für die Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie ohne weitere Verarbeitung. Die Darstellung von markierten Terminals können entweder von lebenden Terminals oder, wenn eine fixierbare Farbstoff analog unter Verwendung von nach dem Fixieren und weitere histologische Verarbeitung.
Wir haben dieses Präparat verwendet , dass die Membran zu zeigen , das Recycling in den lanceolate Endungen auftritt, belegt durch die Aufnahme (Endozytose) und Release (Exozytose) eines Styrylpyridinium- Farbstoff (FM1-43; N – (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (Dibutylamino) styryl) pyridinium Dibromid). Der Farbstoff nicht tut, scheint jedoch deutlich die Investition Schwann Zelle 2 verarbeitet zu beschriften. Wir zeigten auch, dass dieser Farbstoff-Aufnahme / Freisetzung und damit r MembraneCycling, unterliegt glutamatergen Modulation durch eine atypische (Phospholipase D-gekoppelt) metabotropen Glutamatrezeptor. Die Ergebnisse der einfachen Stimulation und Analyseprotokolle dargestellt sind, und gemeinsame Potenzialanalyse Probleme werden ebenfalls hervorgehoben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bewick und Betz diejenigen entwickelt , die N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (Dibutylamino) styryl) pyridinium Dibromid bezogenen Styrylpyridinium- Farbstoffe 7-10 lokale Recycling synaptischer Vesikel Membran zu überwachen. Die Farbstoffaufnahme und damit eine erhöhte Fluoreszenz spiegelt daher synaptischen Vesikelmembran Internalisierung (Endozytose). Anschließend kann diese internalisiert Farbstoff durch weitere elektrische Aktivität wieder freigegeben werden, überwacht die Vesikelmembran Externalisierung Farbstoffverlust zeigt (Exozytose). In Synapsen, dies ist ein Proxy für Neurotransmitter-Ausschüttung. Zur gleichen Zeit fanden wir auch diese Farbstoffe 7 primäre mechanosensorischen Nervenendigungen beschriften. In jüngerer Zeit 11, zeigte Bewick, Banken und Kollegen dann , dass dies in den reifen, differenzierten mechanosensorischen Terminals ex vivo einen ähnlichen Prozess widerspiegelt. Auch hier bezeichnen die Farbstoffe 50 nm Durchmesser 'synaptic-like' Vesikel (SLVs), die konstitutiv recyceln Glutamat freisetzen.In mechanosensorischen-Terminals, im Gegensatz zu ihren synaptischen Kollegen ist dies in erster Linie Recycling spontan. Es wird auch durch mechanische, anstatt einfach elektrische Stimulation moduliert.
Für sensorischen Neuronen in der Kultur und in Cochlea Haarzellen, Styrylfarbstoffe im Allgemeinen und Styrylpyridinium- Farbstoff insbesondere wurde gezeigt , durch die mechanosensorischen Kanäle passieren, die mechanosensorischen Kanäle blockiert und Kennzeichnung irreversibel inneren Membranen 12. Jedoch bei vergleichbaren Styrylfarbstoffs Konzentrationen in differenzierten mechanosensorischen Terminals in situ, wie hier in lanceolate Endungen 2 oder in Ia Endungen in Muskelspindeln 11, und in Haarzellen, die nicht mechanisch 13 angeregt, 14, Kennzeichnung ist durch Membran Endozytose. In mechanosensorischen Nervenendigungen, zum Beispiel, die Kennzeichnung ist reversibel und blockiert nicht die mechanosensorischen Antworten bei den Konzentrationen hier 2 verwendet, 11, 15. Während einige Farbstoff Internalisierung durch Kanal Permeation in diesen Endungen kann nicht vollständig ausgeschlossen werden, die in der Nähe von insgesamt destain mit Latrotoxin zeigt die große Mehrheit der Etikettierung in reifen Terminals ist durch Internalisierung mit Recycling Vesikelmembran. Wir haben, verwendet daher diese Technik 11 die Aktivität Abhängigkeit zu studieren und, in jüngster Zeit, die Pharmakologie 2 von SLV Recycling in mechanosensorischen afferenten Terminals von Arzneimittelwirkungen auf die Aufnahme und Freisetzung der Farbstoffe zu untersuchen.
Wie bei den meisten praktischen Techniken erfordert Reproduzierbarkeit Wiederholung und Praxis. Einige der wichtigsten Punkte für die Zuverlässigkeit sichergestellt wird nun diskutiert. Lanceolate Kennzeichnung bei jüngeren Tieren ist zuverlässiger – das kleinste Tier, das wir verwendet haben, betrug 15 g Körpergewicht. Es ist nicht ganz klar, warum dies der Fall ist, aber es kann sein, weil Dissektion der jüngeren Binde- erfordert Gewebe weniger mechanisches Trauma und leAves weniger verbleibende Rückstand, wenn das Gewebe Entfernen der Innervation Schicht liegt.
Insgesamt ist die Gewebepräparation ganz einfach, mit den Hautschichten auseinander Abziehen der technisch anspruchsvollsten praktischen Aspekt zu sein und dann nur bei älteren Mäusen. In diesen haften die Hautschichten an der Basis stark zusammen, wo die Dissektion beginnt, aber auch hier eine Trennung der Schichten wird viel einfacher gegenüber den Rändern. Zum Glück, oder vielleicht damit diese dünneren Randhautbereiche geben in der Regel die meisten zufrieden stellende Kennzeichnung, wie die vordere Haut tut im Allgemeinen. Deshalb, vor allem vermeiden, an den Rändern der sehr dünnen Haut zu erfassen. Um das Risiko von Schäden zu minimieren, zu manipulieren Vorbereitungen indirekt mit geschlossenen Zange drückt, anstatt Greifen direkt oder wenn wesentliche Griff nur härtere Gewebe kaum markiert werden. Seien Sie gründlich bei der Entfernung der 'Schicht- Polystyrol' Schicht sofort die Follikel liegt, da dies die Haupt michmechanische Behinderung Bildgebung und Drogen-Zugang. Allerdings ist es wichtig , physischen Kontakt mit den zugrunde liegenden Strukturen wie diese Schäden möglichst gering zu halten (dh Streifen weg) die neuronalen Netze und Endgeräte direkt unterhalb. Wenn die vorherrschende Fluoreszenz gelb / weiß in den Talgdrüsen ist, prominente Autofluoreszenz der Haarschaft Basen und einige Sicheln von orange / gelb lanceolate Endungen, deutet dies auf die Nervengeflechte Schicht und die damit verbundenen lanceolate Terminals während Clearance entfernt worden ist. Dies scheint das Hauptproblem bei älteren (> 30 g) Mäusen zu sein. Während der Färbeverfahren, sicherzustellen, alles bei 30 ° C ist und gut mit Sauerstoff angereichert. Beachten Sie, dass markierte Terminals noch am Leben sind. Folglich wird Farbstoff durch laufende spontane (konstitutiv) Exozytose-Freisetzung sezerniert werden. Dies wird bei R / T langsamer sein, aber es ist eine gute Praxis, die Verzögerung zwischen der Entfernung von Chelator-Lösung und Bildgebung zu minimieren, Farbstoffverlust zu minimieren. Außerdem wird für zwischen den Gruppen Vergleichs sTUDIEN der Intensität, ist es wesentlich, Abbilden aller Gruppen zu gewährleisten ist zeit abgestimmt. Verwendung eines Farbstoff-Chelatbildner vor der Bebilderung deutlich verbessert Bildkontrast. Während also relativ teuer ist, ist die Chelat-Schritt sehr wichtig für die Gewährleistung einer guten Bildqualität. Chelator Verwendung kann durch Wiederverwendung der Lösung mehrmals minimiert werden, und sogar auf 2 bis 3 aufeinanderfolgenden Tagen, gelagert bei 4 ° C zwischen den Anwendungen. Entsorgen Sie die Chelator-Lösung, sobald es merklich rosa geht, zeigt seine Farbstoff-Sequestrierung Sättigung nähert.
Während der Bilderzeugung beachten des Potenzials für phototoxische Schädigung dieser lebenden Terminals, die eine kumulative Ergebnis sowohl die Intensität und die Bestrahlungszeit des Anregungslichtes. Diese Überlegung ist weniger wichtig für einzelne Bilder Zeitpunkt, wo die Bildqualität das Hauptanliegen ist. Jedoch ist es während wiederholter Bildgebung in kinetische Studien entscheidend Anregungslichtexposition auf ein Minimum zu reduzieren. Während der Entwicklung dieser FarbstoffeLabel Synapsen, fanden wir Anregung für> 1 min bei voller Leistung Anregungsbeleuchtung wird dramatisch und irreparable Schäden an den Nervenenden führen. Sie erweitern zuerst anschließend enorm, dann kollabiert vollständig über einen Zeitraum von ca. 15 min. Wir prüften nicht systematisch die relativen Beiträge von Belichtungszeit und Intensität, aber diese Beobachtungen legen nahe, das Leitprinzip sowohl zu minimieren sollte. So empfiehlt es sich, Anregungslichtintensität und Dauer sind das Minimum angemessen mit guten Bildern bekommen, und geeignete Kontrollbilder werden in Zeitverlaufsstudien gemacht. Um zu testen, dass die Daten nicht von Phototoxizität bei wiederholter Bildgebungsbedingungen betroffen sind, zu jedem Zeitpunkt nehmen ein zusätzliches Bild eines zuvor ungesehenen Terminal. Dies ist das Verhalten der Markierung in naive Klemmen zu gewährleisten ähnelt in Follikel wiederholt abgebildet wird.
Eine Reihe von Faktoren können die innerhalb der Gruppe Variabilität der Nettointensität d reduzierenata. Genaue Platzierung der ROIs, insbesondere die Hintergrund ROI, ist wichtig, da sogar kleine Bereiche ungeeigneter Färbung stark zwischen Follikel-Datenvariabilität beeinflussen können. Die Variabilität der Nettointensität wird auch durch, wie vollständig jedes Haar beeinflusst Follikel durch die Palisade aus Endungen umgeben. Vergleichen Sie zum Beispiel die sichelförmige Verteilung Kennzeichnung in 1B mit dem nahezu vollständig kreisförmigen Muster in Abbildung 2 zu sehen ist . Komplexere Analyse, vielleicht mit automatisierten Software – Erkennung und Schwellwertbildung, sind notwendig , wenn der Grad der Einkreisung ein relevanter Parameter ist. Bitte beachten Sie, dass die Intensitätsverteilungen selbst für die genau analysiert Follikel Gruppen nicht normalverteilt sind (siehe Abbildung 3), was die Verwendung von nicht-parametrischer Statistiken für zwischen-Behandlung Vergleiche der Bevölkerung Mediane eher als Mittel. Normalisierungstechniken wie Intensitäten als Prozentsatz o exprimierendenf kontralaterale Kontrolle oder einer Kontrollgruppe aus mehreren Zubereitungen können Variabilität weiter zu reduzieren, angewandt werden. Die endgültige technische Artikel zu betrachten, ist die experimentelle Design für pharmakologische Tests. Während pharmakologische Untersuchungen vorge inkubieren die Herstellung der Arzneimittellösung 30 min vor dem Farbauftrag. Dann halten die Arzneimittelkonzentration in der Farbstofflösung. In der Kontrollgruppe, verwenden entweder Kochsalzlösung oder, wenn das Medikament in einem Fahrzeug, Kochsalzlösung und Träger gelöst wird.
Der vorliegende Beitrag zeigt, wie diese neue Ohrmuschel Vorbereitung qualitativ hochwertige Bilder von mechanosensorischen Digungen in der Haut mit minimaler Vorbereitung bietet. Wir zeigen auch, kann es die Pharmakologie von zwei kritische Aspekte der Vesikelrecycling zu untersuchen verwendet werden. Wir zeigen zunächst, dass ein Glutamat-Rezeptor-Agonist Farbstoff Internalisierung erhöhen kann (ein Marker der Endozytose) und zweitens, dass Farbstoff verloren wieder mit Latrotoxin (ein Stimulans der Exozytose). Die Bedeutung dieser preparatIon und Technik ist , dass es auf lebende Haut mechanosenory Terminals in situ für die Bildgebung Experimente Man erhält einzigartige Möglichkeiten für die optische Überwachung von Terminal – Funktion, Struktur und deren Beziehungen untereinander einen ausgezeichneten Zugang bietet. Zu diesem letzteren Zweck haben wir entwickelt es auch weiter für den Einsatz in kombinierten optischen / elektrophysiologische Untersuchungen (siehe Schwester JoVE Artikel für weitere Details).
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde von der britischen Medical Research Council Projektförderung G0601253 GSB und RWB und einem SULSA Bioskape Zuschuss an GSB finanziert
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
Referenzen
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
