Scrutando Cervello polisomi con microscopia a forza atomica

La sintesi delle proteine ​​è la più processo consumo di energia nelle cellule ^1,2. Quindi, non è sorprendente che abbondanza di proteine ​​sono controllate principalmente al traslazionale piuttosto che ^3,4,5 livello trascrizionale. Il polysome è il componente macromolecolare fondamentale che converte le informazioni mRNA in letture proteici funzionali. Polisomi sono finora riconosciuti come complessi macromolecolari dove diversi controlli traslazionali convergono ^6-13. Nonostante centinaia di studi sulla struttura dei ribosomi ^{14- 16,} le intuizioni molecolari dettagliata delle dinamiche della traduzione e della topologia di polisomi è verificato un interesse limitato. Di conseguenza, l'organizzazione del complesso polisomale ribonucleoproteico nativo e il suo potenziale effetto sulla traduzione sono ancora problemi piuttosto oscuri. Polisomi possono nascondere ancora organizzazioni ordinate e funzionali sconosciuti, potenzialmente mirroring quali nucleosomi e Contro epigeneticols hanno rappresentato per il campo di trascrizione. In effetti, l'indagine di questa ipotesi intrigante richiede ulteriori studi e nuovi approcci tecnici. In questa linea, le tecniche strutturali e microscopia a forza atomica possono proficuamente collaborare per svelare nuovi meccanismi per il controllo dell'espressione genica, in modo simile a quanto realizzato per il nucleosoma ^17,18.

Dalla scoperta del ribosoma ^14-16, la sua struttura è stata ampiamente caratterizzata procarioti ^19,20, lievito ²¹ e più recentemente in umano ^22, fornendo la descrizione molecolare dei meccanismi alla base della sintesi proteica. Polisomi sono stati inizialmente rilevati sulla membrana del reticolo endoplasmatico, formando organizzazioni geometriche 2D tipici ^14. Come accennato prima, polysome assembly non è stato oggetto di interesse costante come la struttura ribosoma. In passato, polisomi sono stati studiati essenzialmente trtecniche asmissione EM-based. Solo di recente, le tecniche di crio-EM hanno consentito la ricostruzione 3D della polisomi purificati dai sistemi in vitro di traduzione ^23-26, lisati cellulari umani ²⁷ o ²⁸ nelle cellule. Queste tecniche offerto informazioni più raffinata sull'organizzazione ribosoma-ribosoma in polisomi ^{23, 26-28} e una descrizione molecolare preliminare delle superfici di contatto dei ribosomi adiacenti in polisomi germe di grano ^24. Così, Cryo-EM tomografia permette la divulgazione delle interazioni ribosoma-ribosoma con dettaglio molecolare, ma è gravata da un ampio post-elaborazione e analisi di ricostruzione che richiedono risorse di calcolo pesanti per la gestione dei dati. Inoltre, per ottenere dettaglio molecolare delle interazioni ribosoma-ribosoma, è necessaria una mappa altamente risolto del ribosoma, e questo tipo di ribosoma riferimento è disponibile solo per poche specie. È importante sottolineare che, Cryo-EM tomografia non è in grado di rilevare l'RNA libero. Therefminerale, nuove tecniche sono necessari per comprendere appieno l'organizzazione della macchina di traduzione.

Accanto a Cryo-EM, AFM è stato anche impiegato come uno strumento utile per l'imaging diretto di polisomi negli eucarioti inferiori ^29-33 e gli esseri umani ^27. Rispetto a EM, AFM non richiede la fissazione del campione o l'etichettatura. Inoltre, le misurazioni possono essere eseguite in condizioni fisiologiche vicino e con la possibilità unica di individuare chiaramente sia ribosomi e filamenti di RNA nudi ^27. Imaging singoli polisomi può essere eseguita in tempi relativamente brevi, ottenendo migliaia di immagini a nano risoluzione con poco sforzo di post-trattamento rispetto al vasto e pesante post-elaborazione e ricostruzione delle analisi previste dalla crioconservati microscopia-EM. Di conseguenza, AFM manipolazione e l'analisi dei dati non ha bisogno di posti di lavoro costosi e potenza di calcolo. Come tale, questa tecnica raccoglie informazioni su forme polisomale, caratteristiche morfologiche (ad esempioaltezza, lunghezza e larghezza), densità ribosoma, la presenza di RNA libero e il numero dei ribosomi per polysome ²⁷ con un volume maggiore di crio-EM. In tal modo, AFM rappresenta un approccio potente e complementare alle tecniche EM per ritrarre polisomi ^27.

Qui vi presentiamo una pipeline completa da purificazione per l'analisi dei dati in cui AFM viene applicata all'immagine e analizzare il mouse polisomi cerebrali. Il protocollo proposto concentra sui problemi di depurazione e sulla deposizione accurata di polisomi su substrati mica che vengono utilizzati per l'imaging AFM. Oltre all'analisi delle particelle convenzionale che può essere facilmente effettuata con il software comune usato dalla comunità AFM, un plugin ImageJ ^34, chiamato RiboPick, viene presentato per il conteggio del numero dei ribosomi per polysome ^{27, 35.}