La raccolta selettiva di Marginating-polmonari leucociti
Summary
Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.
Abstract
Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.
Introduction
I leucociti aderenti ai capillari dei polmoni (ad esempio, marginating-polmonare (MP) leucociti) 1 sono stati mostrati ad esporre distinti composizione dei leucociti e l'attività unico rispetto ai leucociti da altri comparti del sistema immunitario (ad esempio, la circolazione, milza, midollo osseo) 2- 4. Ad esempio, mostra MP-leucociti superiore cellule natural killer (NK) citotossicità contro varie cellule tumorali, rispetto al circolanti e milza cellule NK, così come i livelli differenziati RNA messaggero (mRNA) e aumento della secrezione di citochine pro e anti-infiammatori. La composizione delle cellule è anche differenziata da leucociti circolanti come MP-leucociti hanno un rapporto più elevato di immunità innata / adattativa rispetto ai leucociti circolanti (50% contro 30%, rispettivamente). L'obiettivo del metodo qui presentato è quello di consentire la raccolta selettiva di MP-leucociti, per studiare questo compartimento immunitario importante ed unico (popolazione cellulare), e elucIDATE l'impatto delle varie manipolazioni (ad esempio, attivazione immunitaria) su queste cellule specifiche.
Per comprendere il significato di questa popolazione unica, è importante notare che il sistema immunitario può controllare cellule tumorali, micrometastasi e malattia residua che circola attraverso funzioni in vivo di immunità cellulo-mediata (CMI). Questa capacità è evidente nonostante il fallimento precedente del sistema immunitario di controllare il tumore primario, e supportato da ampia evidenza in vivo in pazienti oncologici e modelli animali 5. È importante sottolineare che questi risultati sono spesso in contrasto con in vitro ed ex vivo studi che riportano che la maggior parte delle cellule tumorali autologhe sono resistenti alla citotossicità dai leucociti nei campioni di sangue che circola da esseri umani e gli animali (misurata mediante saggi di citotossicità) 6,7. Questa discrepanza può essere attribuita alla presenza in vivo di popolazioni leucocitarie distinte, come il giàmenzionata popolazione leucocitaria MP, e in particolare la sua sottopopolazione di cellule NK attivate 3. Infatti, le cellule tumorali singenici (MADB106), che sono risultati essere resistenti alla circolazione e leucociti splenici, hanno dimostrato di essere lisate dalle cellule MP-NK 3,8. Così, le cellule MADB106 presumibilmente 'NK-resistenti "che metastatizzano polmoni di fischer344 (F344) ratti sono controllati da cellule MP-NK, ma non da cellule NK spleniche, comunemente studiato a causa della loro facilità di accesso circolante o.
Purificata e attivi MP-leucociti sono inaccessibili attraverso i metodi di raccolta standard dei leucociti dai polmoni, che si basano sulla macinazione tessuto polmonare o degradazione biologica 9. Il nostro approccio ha due grandi vantaggi rispetto agli approcci di lavorazione dei tessuti. Innanzitutto, l'approccio perfusione raccoglie selettivamente MP-leucociti, separandole da altre cellule che provengono dal parenchima polmonare, interstiziale, e compar bronco-alveolaretments. In secondo luogo, la tecnica di perfusione meglio preserva l'integrità e l'ambiente fisiologico MP-leucociti, a differenza della macinazione e trasformazione biologica approcci che danneggiano le cellule, alterano la morfologia e inducono la produzione e il rilascio di vari fattori che modulano l'attività immunitaria e specificamente sopprimono NK citotossicità 10.
I polmoni sono un importante organo bersaglio per le metastasi del cancro e per varie malattie infettive. Tutte le cellule maligne circolanti e cellule infettate passano attraverso i capillari polmonari, dove devono deformarsi e interagire con le cellule endoteliali dei capillari e leucociti residenti. In queste condizioni, le cellule circolanti possono essere facilmente bersaglio di MP-leucociti residenti. Sembra quindi biologicamente vantaggioso avere leucociti attivati in questo compartimento immunitario, ed è importante studiare questo unico MP-popolazione in impostazioni biologici, sperimentali e clinici differenti. E 'degno di nota che syattivazione stemic immune dai vari risposta modificatori biologici (ad esempio, l'acido polyinosinic-policitidilico (poli I: C) o di tipo C CpG oligonucleotidi (CpG-C ODN)) hanno dimostrato di attivare la MP-leucociti più di leucociti circolanti 3, 8,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui presentata consente la raccolta selettiva e studiando della popolazione unica di MP-leucociti. Rispetto al circolante o leucociti splenici, la popolazione MP è caratterizzata da una diversa composizione delle sottopopolazioni di leucociti, livelli di attivazione superiori, maggior rilascio di varie citochine, e più elevati livelli di mRNA di pro- e citochine antinfiammatorie 2,3. In particolare, abbiamo dimostrato che le cellule MP-NK sono più citotossico cellule NK circolatori contro varie c…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori e questo lavoro sono stati sostenuti da NIH / NCI concessione # R01CA172138 (a SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |
Referenzen
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