Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Células imunitárias inatas constituem uma proporção essencial das células dentro do microambiente do tumor e têm sido associados com a malignidade de tumores em pacientes e de modelos animais de cancro ^1. Recentemente, tornou-se mais amplamente apreciado que as respostas imunitárias crónicas desempenham papéis críticos na promoção da progressão do tumor, metástase e resistência às quimioterapias ^2. Os macrófagos são células imunes inatos importantes que foram mostrados para regular directamente a resposta das células de tumor à quimioterapia ^3,4. No entanto, o papel dos neutrófilos, os principais intervenientes no sistema imunitário inato, na regulação da resposta do tumor ao tratamento anti-cancro não é conhecido. Os objectivos destes protocolos são a utilização de um método rápido e credível para separar os neutrófilos a partir de amostras de sangue CLL do paciente e para diferenciar células HL60 ao longo da via granulocitica, a fim de estudar o seu papel na regulação da sensibilidade de células de linfoma de agentes anti-linfoma.

<p class= "jove_content"> Os neutrófilos são o componente celular mais abundante do sistema imune inato no sangue ⁵ e agir como uma primeira linha de defesa contra microorganismos invasores ^6. Os neutrófilos têm um papel essencial no aumento de respostas imunes inatas eficazes para além das funções efectoras variáveis ​​em várias condições patológicas ^7. Por conseguinte, um método rápido e credível para isolar os neutrófilos a partir de outras células sanguíneas, tais como o método de separação por gradiente de densidade, é necessário para os estudos in vitro. Usando este método para isolamento de neutrófilos irá facilitar a investigação sobre as funções imunológicas mediadas por neutrófilos in vivo e ex vivo.

A capacidade de obter populações puras de neutrófilos é um primeiro passo importante para a investigação de pacientes com doenças imunológicas ^8. Densidade método de separação por gradiente é uma técnica ideal em que é obtido um elevado rendimento de células. o metod envolve a adição de uma solução de gradiente de densidade na parte inferior de um tubo contendo sangue humano diluído seguido por centrifugação a 300 g durante 35 min, sem ruptura. O anel de células mononucleares é exibida na interface e os neutrófilos residir por baixo da primeira. Este método tem vantagens significativas em relação a outros métodos disponíveis, tais como kits de isolamento de neutrófilos que são muito mais caros ^9. Além disso, o isolamento de neutrófilos do sangue humano por kits comerciais utilizando anticorpos dirigidos para um marcador de superfície específico para os neutrófilos humanos, aumentam o risco de activação ou diferenciação celular. Densidade método de separação por gradiente permite o isolamento de neutrófilos dentro de um curto período de tempo. Dentro do mesmo passo, as células mononucleares são também separados e recuperados. É uma técnica fundamental em que um elevado rendimento de células puras obtém-se, a fim de alcançar a integridade funcional.

A fim de imitar o tumor microenvironment, foram realizados experimentos em 3D. Dado a curta semi-vida dos neutrófilos in vitro, as experiências 3D com neutrófilos humanos frescos não são conclusivos. Por este motivo, as células promielocíticas (HL60) são induzidas a diferenciar-se em células de neutrófilos semelhante utilizando os indutores da diferenciação sulfóxido de dimetilo (DMSO) e ácido retinóico (RA). Usando células HL60 diferenciadas (HL60 diff) vai evitar ter diferentes respostas dos neutrófilos, devido ao isolamento de diferentes doadores.

Em 3D vitro modelos de cultura representam um estágio intermediário entre modelos in vitro 2D e modelos in vivo. Na cultura 2D, as células se espalhar sobre a superfície de plástico formando anexos não naturais de células a proteínas desnaturadas que são depositados sobre essa superfície sintética. Por outro lado, as células de cultura na forma 3D anexos célula-célula naturais, uma vez que as células e a matriz extracelular que são sintetizar o material natural ao qual eles estão ligados.Por esta razão, os modelos de co- cultura 3D, especialmente entre as células cancerosas e outros tipos de células, têm sido muito útil para indicar a sua contribuição para o crescimento do tumor, angiogénese e metástases. Como resultado, as culturas 3D fazer a cultura de células de imitar as condições fisiológicas que existem in vivo ^10.