Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Cellule immunitarie innate costituiscono una quota essenziale delle cellule all'interno del microambiente tumorale e sono stati associati con la malignità del tumore nei pazienti e modelli animali di cancro ^1. Recentemente, è diventato più ampiamente apprezzati che le risposte immunitarie croniche giocano ruoli critici nella promozione progressione tumorale, metastasi e resistenza alle chemioterapie ^2. I macrofagi sono importanti cellule immunitarie innate che hanno dimostrato di regolare direttamente la risposta delle cellule tumorali alla chemioterapia ^3,4. Tuttavia, il ruolo dei neutrofili, i principali attori del sistema immunitario innato, nella regolazione della risposta del tumore alla terapia anti-cancro non è noto. Gli obiettivi di questi protocolli sono di utilizzare un metodo veloce e credibile per separare neutrofili da campioni di sangue CLL del paziente e di differenziare le cellule HL60 lungo il percorso granulocitica al fine di studiare il loro ruolo nel regolare la sensibilità delle cellule di linfoma di agenti anti-linfoma.

<p class= "jove_content"> I neutrofili sono la componente cellulare più abbondante del sistema immunitario innato nel sangue ⁵ e ad agire come una prima linea di difesa contro i microrganismi invasori ^6. I neutrofili hanno un ruolo essenziale nella nascente efficaci risposte immunitarie innate, oltre alle funzioni effettrici variabili in diverse condizioni patologiche ^7. Pertanto, un metodo veloce e credibile isolare neutrofili dalle altre cellule del sangue, come metodo di separazione gradiente di densità, è necessaria per gli studi in vitro. Usando questo metodo per l'isolamento dei neutrofili faciliterà ulteriori ricerche sulle funzioni immunologiche neutrofilo-mediata in vivo ed ex vivo.

La possibilità di ottenere popolazioni pure di neutrofili è un primo passo importante per lo studio di pazienti con malattie immunologiche ^8. Densità metodo di separazione gradiente è una tecnica ideale in cui si ottiene un elevato rendimento di cellule. il method comporta l'aggiunta di soluzione gradiente di densità nella parte inferiore di un tubo contenente sangue umano diluito seguita da centrifugazione a 300 g per 35 min senza interruzione. L'anello delle cellule mononucleari appare a livello di interfaccia e neutrofili risiedere al di sotto del primo. Questo metodo ha vantaggi significativi rispetto ad altri metodi disponibili come kit di isolamento dei neutrofili che sono molto più costosi ^9. Inoltre, isolando neutrofili dal sangue umano da kit commerciali utilizzando anticorpi diretti ad un marcatore di superficie specifico per neutrofili umani, aumentare il rischio di attivazione delle cellule o la differenziazione. Densità metodo di separazione gradiente consente l'isolamento dei neutrofili entro un breve periodo di tempo. Entro lo stesso passo, cellule mononucleari vengono separati e recuperati. E 'una tecnica fondamentale in cui si ottiene un elevato rendimento di cellule puri per conseguire integrità funzionale.

Al fine di simulare il microenv tumoreironment, sono stati effettuati esperimenti di 3D. Data la breve emivita dei neutrofili in vitro, gli esperimenti 3D con neutrofili umani freschi non sono conclusivi. Per questo motivo, promielocitica cellule (HL60) vengono indotte a differenziarsi in cellule neutrofili simili che utilizzano gli induttori di differenziazione dimetilsolfossido (DMSO) e l'acido retinoico (RA). Utilizzando cellule HL60 differenziate (HL60 diff) impedirà avere diverse risposte dei neutrofili a causa di isolamento da diversi donatori.

In 3D vitro modelli di coltura rappresentano una fase intermedia tra i modelli in 2D in vitro e in modelli in vivo. Nella cultura 2D, le cellule sparse sulla superficie di plastica formando allegati cellulari innaturali alle proteine ​​depositati che sono denaturate su questa superficie sintetica. Viceversa, le cellule allegati cellula-cellula naturale forma coltura 3D poiché le cellule e la matrice extracellulare sintetizzano sono il materiale naturale a cui sono attaccati.Per questo motivo, i modelli co-coltura 3D, in particolare tra le cellule tumorali e di altri tipi di cellule, sono stati molto utili per indicare il loro contributo alla crescita del tumore, l'angiogenesi, e le metastasi. Come risultato, culture 3D rendono la coltura cellulare mimare le condizioni fisiologiche che esistono in vivo ^10.