فحوصات النوعية والكمية للكشف وتوصيف مضادات الميكروبات البروتين
Summary
Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.
Abstract
Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.
Introduction
Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and α-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.
Protocol
Representative Results
Discussion
فحص شريحة مجهرية نشر والفحص صبغ الإفراج توفر مزايا للكشف عن وتميز مضادات الميكروبات البروتين مجهولة سابقا. هذه الطرق السريعة والحساسة تسمح فحص عالية الإنتاجية من المكتبات مصدر الكائن الحي للتعرف على الانزيمات التي تهم سابقة للاستثمار موارد البحث أكبر. كما يتم تحديد الانزيمات هدف رفيعة، والاختلافات من فحوصات الكشف يمكن استخدامها للكشف بسرعة الانزيم أو لتحديد الخصائص الكيميائية الحيوية للانزيم. على سبيل المثال، خلال خطة تنقية البروتين متعددة الخطوات، يمكن فحص شريحة مجهرية نشر كشف بسرعة الكسور التي تحتوي على انزيم من الفائدة. وبالإضافة إلى ذلك، رد فعل أوبتيما للانزيم يمكن تحديده من خلال تغيير مخازن رد فعل ودرجات الحرارة حضانة في الفحص صبغ الافراج عنهم.
مجموعة من كتلة انزيم اللازمة للكشف في فحص شريحة مجهرية نشر هو وظيفة من characteri انزيمعصي. تتطلب القيود كشف الفحص عموما استخدام كميات أكبر من انزيم من الفحص صبغ الافراج عنهم. في هذه الدراسة، أوضحت المقارنة من حدود الكشف عن مقايسة شريحة مجهرية نشر (الشكل 1) إلى صبغ الإفراج فحص (الشكل 4) أن فحص شريحة مجهرية نشر هو أسلوب أقل حساسية من فحص صبغ الافراج عنهم. عندما تركيز انزيم ليست مصدر قلق، وفحص شريحة مجهرية يسمح للفحص الأولي السريع للمكتبات لإنتاج مضادات الميكروبات البروتين ضد ركائز الهدف مع مطالب العمال والمعدات منخفضة. على الرغم من أن تتطلب المزيد من الجهد والمعدات، وفحص صبغ الإصدار هو أكثر حساسية وقابلة للتكرار، مما أسفر عن النتائج الكمية التي تسمح بالمقارنة بين المقايسات صبغ الإفراج عن نفس أو مختلفة الانزيمات لركيزة معينة. يتم تنفيذ الطريقتين بسهولة في معظم المختبرات الميكروبيولوجية دون الحاجة إلى أجهزة متخصصة للغاية. في الممثلين،المقايسات التوالي، فيما انزيم السيطرة، ألفا-كيموتربسين، تم الكشف على كميات منخفضة تصل إلى 100 نانوغرام (الشكل 5) باستخدام الفحص صبغ الإفراج عنهم، في حين أن الحد الأدنى الكشف في فحص شريحة مجهرية نشر 1 ميكروغرام (لا تظهر البيانات).
توفير المرافق كما فحص الكشف النوعي للأنزيمات المضادة للميكروبات، تم الإبلاغ عن عدد من الاختلافات مقايسة نشر 11،13. وعند استعراض هذه المقايسات، تم تطوير فحص شريحة مجهرية نشر لحساسية عالية نسبيا باعتبارها شاشة الأولي ولسهولة الاحتفال رد فعل. تعديل من عمل Lachica وآخرون. 11، التي استخدمت فيها تراكب الاغاروز للكشف عن إنتاج nucleases من سلالات المكورات العنقودية الذهبية، ونشر فحص شريحة مجهرية تعمل بطريقة مشابهة لطريقة المناعي شعاعي 14 كما ينشر البروتين من البئر في الاغاروز تحتوي على الركيزة. وimmunodiffu شعاعييوقف طريقة سيون التوسع في منطقة مناعي عندما يصل نظام توازن تشكيل المعقد بين المستضد نشرها والأجسام المضادة داخل الاغاروز. في المقابل، فإن الركيزة مقايسة شريحة مجهرية نشر يهضم في البداية من قبل نشرها مضادات الميكروبات البروتين في منطقة التوسع المستمر للتحلل المحيطة أيضا. يستمر قطر المتزايدة للمنطقة حتى يفقد الإنزيم النشاط أو تم استنفاد الركيزة. وتسارع معدل إنتاج المنطقة من تحلل كما نقاء، وبالتالي فإن نشاط معين من الأنزيمات أو تركيز الانزيم تضاف إلى الزيادة أيضا.
لتقييم كمي النشاط الأنزيمي من مضادات البروتين ضد قتل حرارة B. الرقيقة، وقد تم اختيار الفحص صبغ الافراج عنهم. المقايسات اللونية باستخدام Remazol الأزرق اللامع R صبغ (RBB) -labeled ركائز تسمح تقييم تنوعا وحساسة من البروتين activi مضادات الميكروباتتاي. الإنزيمية النتائج الركيزة المسمى RBB في الإفراج عن المنتجات الزرقاء القابلة للذوبان التي يمكن قياسها بسهولة من قبل معمل في 595 نانومتر. العديد من الاختلافات من RBB صبغ الافراج عن الفحص، وضعت لتوصيف البروتين الانزيمات المضادة للميكروبات أخرى، تظهر مرونة هذا الاختبار للتطبيق مع ركائز أخرى. على سبيل المثال، في تحديد آثار يزوستافين النشاط للجراثيم، تشو، وآخرون. وذكرت فحص صبغ الإفراج باستخدام الخلايا العنقودية مصبوغ RBB والمكورة العنقودية ببتيدوغليكان بمثابة ركائز 12. في تعديل لتطبيق هذا RBB صبغ الافراج عن الفحص، واقترح المسمى RBB-ميكروكوكس luteus الركيزة لاستخدامها كوسيلة سريعة وحساسة للتشخيص وشاشة لأمراض مثل عدوى بكتيرية وجود سرطان خبيث، والتي يمكن أن تكون مرتبطة إلى مستويات التعبير الليزوزيم الإنسان في مصل الدم (15). وبالإضافة إلى ذلك، وصفت RBB ركائز الخلية البكتيرية لديهايسوتو استخدمت في طريقة zymogram للكشف عن الليزوزيم (16).
علينا أن نبرهن على حد خفضت الكشف، والراحة، واستنساخ للفحص صبغ الإفراج، مما يسمح للفحص مكتبة السريع لانتاج الانزيم. التعديلات للمقايسة تسمح المصب فحوصات توصيف البيوكيميائية الكمية، بما في ذلك آثار درجات الحرارة، ودرجة الحموضة، والملوحة، وكذلك آثار من الإنزيمات المحللة للبروتين أخرى على نشاط البروتينات المضادة للميكروبات 6. وبالإضافة إلى ذلك، فإن كمية الصبغة الإفراج الفحص يمكن استخدامها لمقارنة أنشطة الإنزيمات متعددة لالركيزة معين. وقد أفاد RBB صبغ الإفراج فحص أداة لأنزيمات مع النشاط ضد السكريات بالإضافة إلى توصيف والكشف عن بروتين العوامل المضادة للجراثيم. وذكرت بيترسون واريكسون مقايسة للكشف عن النشاط endoglycanase استخدام غير متبلور، والخرز السكاريد مصبوغ RBB من السليلوز، الزيلان، المنان، وشيتفي 17. في التوسع في هذه النتائج، وقد تم تطوير طريقة حساسة للكشف عن الانزيمات التي تنتجها كيتيناز اردة في BT-107 باستخدام كيتين الغروية المسمى مع RBB 18. من هذه الدراسات وغيرها، وظهرت المصادر المتاحة تجاريا من ركائز مصبوغ RBB لاستخدامها في الكشف عن النشاط حال السكر، بما في ذلك ضد الكيراتين، الأميلوبكتين، الأميلوز، الجليكوجين، امينارين، د-الزيلان، جلوكان آزو الشعير، والنشا.
في هذه الدراسة، ونحن لشرح فائدة الفحص صبغ الافراج عنه في شكل صفيحة، والحد من حجم الركيزة المسمى RBB وانزيم اللازمة لإنتاج نتيجة اللونية. كما هو موضح في الشكل (4) والشكل (5)، ويوفر صفيحة صبغ الإفراج فحص حد اكتشاف أقل من فحص نشر شريحة مجهرية للكشف عن النشاط الأنزيمي. وفيما يتعلق باستخدام السريع، والحفاظ على اليد العاملة، وسهولة التفسير، وهيئة التصنيع العسكرييوفر roslide نشر فحص فائدة في شاشات عالية الإنتاجية الأولية لوجود نشاط مضادات الميكروبات فضلا عن الإشارة إلى وجود بروتين مضاد للميكروبات في عزل البروتين وتنقية الخطوات اللاحقة. الجمع بين هذه المقايسات اثنين يكمل كل منهما الآخر في الفرز الأولي وتوصيف النهائي لمضادات الميكروبات البروتين جديدة
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.
Materials
| 48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid | Becton Dickinson | 3078 | |
| 96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) | Corning, Inc. | 3595 | |
| agarose | Fisher Scientific | BP162-100 | |
| α-chymotrypsin | MP Biomedicals | 215227205 | |
| Bacillus subtilis 168 | American Type Culture Collection | 23857 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| cork borer | Humboldt | H-9661 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| McFarland equivalence standard (2.0) | Fisher Scientific | R20412 | |
| microslides | Fisher Scientific | 22-38-103 | |
| nutrient broth | Fisher Scientific | S25959B | |
| peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 | Sigma-Aldrich | 69554-10MG-F | |
| phosphate-buffered saline (1×) | Teknova | P0200 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Life Technologies | 23227 | |
| Synergy HT microplate spectrophotometer | BioTek Instruments, Inc. | ||
| Remazol brilliant blue R dye (RBB) | Sigma-Aldrich | R8001 | |
| Salmonella enterica subsp. enterica | American Type Culture Collection | 10708 | |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film | Diversified Biotechnology | T-TOPS-50 | |
| UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution | |||
| agarose solution 50 ml PBS 0.25 g agarose |
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution | ||
| nutrient broth medium 4 g nutrient broth 500 ml Type I water |
|||
| 250mM sodium hydroxide (NaOH) solution 1 g NaOH 99 ml Type I water |
|||
| 200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 1.25 g RBB 98.75 ml 250 mM NaOH solution |
Referenzen
- Anand, T. P., et al. Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India. Microbiol Res. 161, 252-262 (2006).
- Tagg, J. R., Dajani, A. S., Wannamaker, L. W. Bacteriocins of gram-positive bacteria. Bacteriol Rev. 40, 722-756 (1976).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
- Riley, M. A., Gordon, D. M. The ecological role of bacteriocins in bacterial competition. Trends Microbiol. 7, 129-133 (1999).
- Tenover, F. C. Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. Am J Med. 119, S3-S10 (2006).
- Farris, M. H., Steinberg, A. D. Mitrecin A, an endolysin-like bacteriolytic enzyme from a newly isolated soil streptomycete. Lett Appl Microbiol. 58, 493-502 (2014).
- Dehart, H. P., Heath, H. E., Heath, L. S., Leblanc, P. A., Sloan, G. L. The Lysostaphin Endopeptidase Resistance Gene (epr) Specifies Modification of Peptidoglycan Cross Bridges in Staphylococcus simulans and Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol. 61, 2811 (1995).
- Srivastava, K. K., Siddique, I. H. Quantitative chemical composition of peptidoglycan of Listeria monocytogenes. Infect Immun. 7, 700-703 (1973).
- Heilmann, H. D. On the peptidoglycan of the cell walls of Pseudomonas aeruginosa. Eur J Biochem. 31, 456-463 (1972).
- Schumann, P., Rainey, F., Oren, A. . Taxonomy of Prokaryotes. 38, (2011).
- Lachica, R. V., Genigeorgis, C., Hoeprich, P. D. Metachromatic agar-diffusion methods for detecting staphylococcal nuclease activity. Appl Microbiol. 21, 585-587 (1971).
- Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Anal Biochem. 171, 141-144 (1988).
- Osserman, E. F., Lawlor, D. P. Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leukemia. J Exp Med. 124, 921-952 (1966).
- Mancini, G., Carbonara, A. O., Heremans, J. F. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry. 2, 235-254 (1965).
- Ito, Y., Yamada, H., Imoto, T. Colorimetric assay for lysozyme using Micrococcus luteus labeled with a blue dye, Remazol brilliant blue R, as a substrate. Chem Pharm Bull. (Tokyo). 40, 1523-1526 (1992).
- Hardt, M., Guo, Y., Henderson, G., Laine, R. A. Zymogram with Remazol brilliant blue-labeled Micrococcus lysodeikticus cells for the detection of lysozymes: example of a new lysozyme activity in Formosan termite defense secretions. Anal Biochem. 312, 73-76 (2003).
- Pettersson, B., Eriksson, K. E. A standardized spectrophotometric assay of endoglycanase activities using dyed, amorphous polysaccharides. Anal Biochem. 285, 220-224 (2000).
- Gomez Ramirez, M., Rojas Avelizapa, L. I., Rojas Avelizapa, N. G., Cruz Camarillo, R. Colloidal chitin stained with Remazol Brilliant Blue R, a useful substrate to select chitinolytic microorganisms and to evaluate chitinases. J Microbiol Methods. 56, 213-219 (2004).
