Visualizzazione di Spasmi motilità e caratterizzazione del ruolo del<em> Pell</em> in<em> Fastidiosa Xylella</em
Summary
In questo studio, una camera di flusso nano-microfluidica è stato impiegato per visualizzare e caratterizzare funzionalmente la motilità contrazione del Xylella fastidiosa, un batterio che causa la malattia di Pierce a Grapevine.
Abstract
Xylella fastidiosa è un batterio non flagellated Gram-negativi che provoca una serie di malattie economicamente importanti delle piante. La motilità spasmi fornisce X. fastidiosa un mezzo per il movimento a lunga distanza intra-impianto e la colonizzazione, contribuendo verso patogenicità in X. fastidiosa. La motilità contrazioni di X. fastidiosa è gestito da pili di tipo IV. Tipo IV pili di Xylella fastidiosa sono regolati da Pell, un regolatore di chemiotassi in Pil-CHP proteine di codifica operone che sono coinvolti con le vie di trasduzione del segnale. Per chiarire i ruoli di Pell nella motilità contrazioni di X. fastidiosa, un Pell -carente mutante Xf ΔpilG e il suo sforzo complementare XfΔpilG- C contenente nativo Pell sono stati sviluppati. A camere di microfluidica integrati con un sistema di registrazione di immagini time-lapse è stato utilizzato per osservare spasmi motilità in XfΔpIlg, XfΔpilG- C e il suo ceppo wild-type. Usando questo sistema di registrazione, permette a lungo termine osservazioni spaziali e temporali di aggregazione, la migrazione delle singole cellule e delle popolazioni di batteri via spasmi motilità. X. fastidiosa wild type e complementare ceppo XfΔpilG- C hanno mostrato caratteristiche tipiche spasmi motilità osservati direttamente nelle camere di flusso microfluidica, mentre mutante XfΔpliG esposto il fenotipo carente spasmi. Questo studio dimostra che pilg contribuisce alla motilità spasmi di X. fastidiosa. La camera di flusso microfluidica viene utilizzato come mezzo per osservare spasmi motilità.
Introduction
Xylella fastidiosa è un batterio Gram-negativo non flagellated, patogeno che provoca una serie di malattie economicamente importanti colture, compreso il morbo di Pierce a vite (Vitis vinifera L.) 1,2, 3. Questo batterio è limitata alla xilema conducibilità dell'acqua vasi. L'infezione di vite provoca il blocco dei vasi xilematici e si traduce in stress idrico e carenze nutrizionali 3. Colonizzazione successo dipende dalla capacità del batterio di muoversi dal sito iniziale di infezione per il resto dell'impianto 3. Contrazione motilità è un mezzo di movimento batterica flagellare-indipendente, tramite l'estensione, l'attaccamento, e la scomparsa della tipo polare IV pili 4 che è stato caratterizzato X. fastidiosa 5,6,7.
La motilità contrazione è stato osservato da pinzette laser e microscopia a forza atomica (AFM) 8,9,10. Utilizzando queste tecniche, tmotilità delle streghe generati dal tipo IV pilus di N. gonorrhoeae e P. aeruginosa sono stati caratterizzati da fl pili etichettatura uorescently e catturare i loro movimenti al microscopio. Sebbene entrambi i metodi hanno dettagliato la forza adesiva dei singoli batteri, le procedure sono complicato e lungo 9,10. I micro camere uidic fl sono stati usati per osservare la migrazione a lunga distanza delle singole cellule, così come piccoli aggregati di cellule batteriche 5,6. Queste camere sono state progettate come un microfabbricazione-nano-canale in un piatto integrato con un sistema di registrazione di immagini time-lapse 11,12,13,14. Micro fl dispositivi da camera uidic offrono diversi vantaggi per lo studio delle interazioni comportamentali movimento e cellula-cellula di batteri: (i) fornisce una piattaforma integrata con molteplici funzionalità del canale; (Ii) le spetta esaminare i movimenti e le aggregazioni di singole cellule nelle caratteristiche nano-scala di batteri; (Iii) permette di m direttaicroscopic registrazione delle immagini delle cellule batteriche e analisi time-lapse, (iv) fornisce a lungo termine osservazioni spaziali e temporali di singoli e / o popolazioni di batteri in un micro-ambiente; (V) la portata del mezzo di coltura in un canale può essere controllata con precisione è richiesta (vi) solo un piccolo volume (1 ml) di mezzo di coltura per ciascun esperimento.
Di recente, il micro fl uidic flusso sistema è stato impiegato per studiare i comportamenti di cellule batteriche in diversi microambienti 14,15,16. L'adesività e l'attaccamento superficie E. coli 15, X. fastidiosa 16, e Acidovorax citrulli 14 alle superfici di vetro sono stati valutati utilizzando micro fl camere uidic. La formazione di aggregazione e bio fi lm mediato dal tipo IV pili di Acidovorax citrulli sono stati analizzati 14. Inoltre, il movimento di A. citrulli osservato sotto flusso cONDIZIONI hanno dimostrato che il pili di tipo IV può svolgere un ruolo importante nella colonizzazione e la diffusione di A. citrulli in vasi xilematici sotto alburno flusso condizioni. I motilità contrazione del Pseudomonas aeruginosa e X. cellule fastidiosa sono state osservate con successo contro una corrente di fluido in una camera di flusso microfabbricazione 5,6,17. Tipo IV pilus carente pilB e pilQ mutanti di X. fastidiosa sono stati trovati di alterare profondamente la velocità di spasmi motilità nelle condizioni di fl usso in Micro Devices uidic fl 5,6,18. Gli studi condotti su adesione batterica e la motilità in micro dispositivi uidic fl indicato che i micro fl camere uidic sono particolarmente adatti per l'analisi della motilità contrazioni e la migrazione dei batteri pili mediata in vitro. Questi risultati spiegano il meccanismo di migrazione spasmi-mediata che facilita l'attaccamento cellula-cellula, l'aggregazione e la colonizzazione all'internoil padrone di casa, alla fine portano a infezioni sistemiche.
Pil-Chp operone di X. fastidiosa contiene Pell, Pili, pilJ, pillola, chpB e CHPC quale segnale di trasduzione codifica Percorsi di 20. I chemocettori transmembrana legano stimoli chimici nel dominio periplasmic e attivare una cascata di segnali nella loro porzione citoplasmatica di controllare in ultima analisi batterica motilità spasmi. Nel operone Pil-Chp di X. fastidiosa, una proteina Pell fosfo-navetta è un omologo di CheY. In E. coli e P. aeruginosa, CheY è il regolatore di risposta in sistemi chemiotassi che interagiscono con le proteine motrici flagelli 19, 21. Anche se i contributi di dell'operone Pil-Chp verso virulenza in X. fastidiosa stati esaminati recentemente 20, il ruolo di Pell in chemiotassi operone in risposta ai segnali ambientali e regolata / motore tipo IV pili di X. fastidiosa è uncLear. Per chiarire l'intuizione di regolatore di chemiotassi Pell nell'attività di spasmi motilità di X. fastidiosa, una camera uidic fl micro è utilizzato per valutare la motilità contrazioni di X. fastidiosa. La Pell di X. fastidiosa è caratterizzata confrontando i fenotipi di una delezione mutante Xf ΔpliG, ceppo complementare XfΔpliG -C e la sua wild type in vitro. I risultati evidenziano il ruolo di Pell nella motilità contrazioni di X. fastidiosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo caratterizzato il comportamento movimento di X. fastidiosa Pell mutante Xf ΔpilG ei suoi complementari ceppi XfΔpilG- C a nuova concezione multipla parallelo-nano-canale micro camere di fl uidic. Le camere uidic di nuova progettazione micro fl possono avere fino a quattro camere parallele con 100 micron nano-canale in larghezza rispetto a modelli precedenti con un solo 50 micron di larghezza di canale 18. Il miglioramento più ampio nano…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service. I nomi commerciali o prodotti commerciali in questa pubblicazione sono citati unicamente allo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.
Materials
| Biology materials | |||
| X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type | Costa, H. S., et al., 2004 22 | ||
| pilG deletion mutant XfΔpliG | Shi, X. Y., et al., 2007 26 | ||
| pilG complementary strain XfΔpliG-C | Davis, M. J., wt al. 1998 23 | ||
| Physical materials and equipment | |||
| Disposable inoculating loops | VWR international, Radnor, PA | #22-363-607 | quantitative procedures such as bacterial collection |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | #0002709226 | Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits |
| AmScope MD2000 digital camera | AmScope, Irvine, CA | SE305R-AZ-E | Image, video recording and measurement |
| Tubes line | Edgewood, NY | #T4300 | Connected to the syringe and microfluidic chamber |
| Plastic luer connectors | Edgewood, NY | Connected to the syringe and microfluidic chamber | |
| Syringe pumps | Pico Plus, Harvard Apparatus, MA | #702209 | The flow rate can be adjusted while the pump is running. |
| Syringes | Gastight, Hemilton Company, Reno, NV | #1005 | Provide the flowing broth |
| Inverted Olympus IMT-2 microscope | Olympus | IMT-2 FLuoro PHase | Image observation and recording |
| SPOT-RT digital camera | Diagnostic Instruments, Inc., MI | RT230 | Image, video recording and measurement |
| Microscope Shutter | The UNIBLITZ, US | #LS2T2 | Control camera’s exposure time |
| Microscope Shutter Control system | The UNIBLITZ, US | VCM-D1 | VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver |
| MetaMorph Image software | Universal Imaging Corp., PA | Real-time super-resolution image processing |
Referenzen
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