Feeder-vrij Afleiding van melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen
Summary
Dit werk beschrijft een in vitro differentiatie protocol bij gepigmenteerde, volwassen melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen te produceren via een neurale en melanoblast tussenstap met behulp van een feeder-vrij, 25 dagen protocol.
Abstract
Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.
Introduction
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) bieden een platform om de normale differentiatie na te bootsen in een schaalbare manier voor de ziekte modelleren, drug discovery, en cel vervangende therapieën 1-6. Van bijzonder belang, hPSCs openstellen van mogelijkheden voor het bestuderen van moeilijk te isoleren of zeldzame / transient types cel waar de patiënt monsters zijn schaars. Bovendien, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) onderzoekers in staat om ontwikkeling en ziekte modelleren studeren in een patiënt specifieke manier om unieke mechanismen 1,2,7-11 ontrafelen. De eerder gepubliceerde protocol voor differentiatie van melanocyten uit hPSCs is maximaal 6 weken differentiaties en omvat het kweken van cellen met geconditioneerd medium van L- Wnt3a 12 cellen. Het protocol voor het eerst gepresenteerd door Mica et al., En hier beschreven produceert gepigmenteerde cellen in drie weken en verwijdert de dubbelzinnigheid en inconsistenties in verband met geconditioneerd medium.
melanocyten are afgeleid van de neurale kam, een trekkende populatie cellen uniek vertebraten. De neurale gedefinieerd tijdens gastrulatie en vertegenwoordigt een populatie cellen aan de rand van de neurale plaat, grenzend tussen de neurale en niet-neurale ectoderm. Tijdens neurulatie, het zenuwweefsel evolueert van een neurale plaat neurale plooien, die convergeren in de dorsale middellijn waardoor de neurale buis 13,14 vormen.
De neurale cellen die voortkomen uit de dakplaat van de neurale buis, tegenover de notochord en een epitheliale naar mesenchymale transitie ondergaan vóór de migratie weg om tot een diverse bevolking van gedifferentieerde cellen te geven. Het lot van de kam cellen op een deel van de anatomische locatie van de dakplaat langs de lichaamsas van het embryo. Neurale cel derivaten omvatten lineages kenmerkend zowel mesoderm (gladde spiercellen, osteoblasten, adipocyten, chondrocyten) en ectoderm (melanocyten, Schwann cells, neuronen) 14. Neurale stamcellen reguleert de transcriptiefactor SOX10 en kan worden geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering met antilichamen tegen p75 en HNK1.
De neurale cellen gedoemd om te worden melanocyten passeren een melanoblast podium en upregulate KIT en MITF (-microphthalmia geassocieerde transcriptiefactor) 6,21 MITF is een meester regulator van melanocyten ontwikkeling en is een transcriptiefactor die verantwoordelijk is voor het besturen van een groot deel van melanocyten ontwikkeling 22- 24. Menselijke melanoblasten migreren naar de basale laag van de epidermis wanneer zij ofwel in het haar of uitstulping omgeven door keratinocyten in de epidermis (pigmentatie vormende eenheden) fungeren als voorlopers van de rijpe, gepigmenteerde melanocyten bevinden. De differentiatie en rijping van melanoblasten in gepigmenteerde melanocyten gebeurt gelijktijdig met de kolonisatie van de haarbol en expressie van het melanine traject (TYRP1, TYR, en OCA2PMEL) 25,26.
Het isoleren van menselijke melanocyten en melanoblasten van patiënten is duur, moeilijk en het beperken in kwantiteit. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om hPSCs (geïnduceerd of embryonale) in de melanocyten of melanocyt voorlopers differentiëren in een goed gedefinieerde, snelle, reproduceerbare, schaalbare en goedkope methode zonder celsortering. Het protocol werd vroeger gebruikt om de ziekte-specifieke afwijkingen identificeren wanneer differentiëren iPSCs van patiënten met pigmentatie stoornissen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor de succesvolle differentiatie van melanocyten uit hPSCs de volgende suggesties in overweging moeten worden genomen. Allereerst is het noodzakelijk om onder steriele kweekomstandigheden te allen tijde. Daarnaast is aangevangen met pluripotente volledig ongedifferentieerde hPSCs; indien de startpopulatie gedifferentieerde cellen bevat zal de opbrengst steeds dalen als de verontreinigingen niet kunnen worden gericht op melanocyten en kunnen verder verstoren de juiste differentiërende cellen.
<p class="jove_conten…Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een beurs voor melanoom onderzoekers van de Joanna M. Nicolay Foundation en door de National Institutes of Health onder Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F31. Dit werk werd verder ondersteund door middel van subsidies uit NYSTEM en de Tri-institutionele stamcel-initiatief (Starr Foundation).
Materials
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133–032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032g in 100ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
Referenzen
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
- Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
- White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
- Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
- Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
- Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
- Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
- Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064 (2011).
- Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
- Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
- Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
- Zur Nieden, N. I. . Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , (2011).
- Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).
