Insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi
Summary
Bu çalışma, bir nöral ile insan pluripotent kök hücreleri pigmentli olgun melanosit üretilmesi ve besleyici içermeyen, 25 günlük protokolünü kullanarak ara madde aşama melanoblast için bir in vitro farklılaşma protokolü tarif eder.
Abstract
Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.
Introduction
Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) hastalığı modelleme, ilaç tarama ve hücre replasman tedavileri 1-6 için ölçeklenebilir bir şekilde normal farklılaşma taklit etmek bir platform sağlar. Özellikle ilgi çekici, hPSCs izole etmek zor veya hasta numunelerinin kıt nadir / geçici hücre tipleri çalışmak için yollar açmak. Ayrıca, uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) benzersiz mekanizmaları 1,2,7-11 çözülmeye hasta belirli bir şekilde gelişmesini ve hastalık modelleme incelemek için araştırmacılar sağlar. HPSCs gelen melanosit farklılaşması için önce yayınlanan bir protokolün farklılaşmalar 6 haftaya kadar gerekmektedir ve L-Wnt3a hücreleri 12 kıvamlandırılmış ortamı ile kültür hücreleri içerir. Protokol ilk Mika ve arkadaşları tarafından sunulan. Ve tarif burada üç hafta içinde pigmentli hücreler üretir ve belirsizlik ve koşullandırılmış ortam ile ilişkili tutarsızlıkları ortadan kaldırır.
melanosit arnöral, omurgalılar özgü hücrelerin göç nüfusu türetilen e. nöral krest gastrulasyon sırasında tanımlanan ve nöral ve nöral olmayan ektoderm arasında sınırındaki nöral plaka kenarında hücre popülasyonu temsil etmektedir. Nörülasyon sırasında, sinir dokusu nöral tüp 13,14 sonuçlanan dorsal orta hat yakınsama sinir kıvrımlar oluşturmak için bir nöral plaka gelişir.
nöral krest hücreleri Notokordun karşısında, nöral tüpün çatı plakası ortaya ve farklılaşmış hücrelerin çeşitli bir nüfusa yol vermek için uzağa göç önce mezenkimal geçiş bir epitel uğrar. tepe hücreleri kaderi embriyo gövde ekseni boyunca tavan plakasının anatomik bölgeye kısmen tanımlanır. Nöral tepe hücresi türevleri, hem mezoderm karakteristik soy (düz kas hücreleri, osteoblastlar, adipositler, kondrositler) ve ektoderm hücrelerini içerir (melanosit Schwann Cıarşın, nöronlar) 14. Sinir tepe kök hücreler transkripsiyon faktörü SOX10 upregülasyon yapabileceğini ve p75 ve HNK1 antikorlar ile sıralama floresans ile aktive edilmiş hücre ile izole edilebilir.
Melanosit bir melanoblast aşamadan geçmesi ve 6,21 MITF melanosit gelişim ana düzenleyicisidir ve bir transkripsiyon faktörü melanosit gelişiminin çok kontrol sorumludur KIT ve MITF (mikroftalmi ilişkili transkripsiyon faktörü) upregüle olmaya mahkum nöral krest hücreleri 22- 24. İnsan Melanoblastlardan onlar saç şişkinliği veya Epidermisin keratinositlerin çevrili olgun, pigmentli melanosit için öncüleri olarak hizmet vermeye (pigmentasyon birimleri oluşturan) ya ikamet epidermisin bazal tabakasındaki göç. pigmentli melanosit içine Melanoblastlardan farklılaşması ve olgunlaşması saç ampul kolonizasyon ve ifade melanin üretimi yolunun (TYRP1, TYR, OKA2'den ve ile birlikte oluşurPMEL) 25,26.
Hastaların insan melanosit ve Melanoblastlardan Ayırma, pahalı zor ve miktar sınırlayıcı olduğunu. Bu protokol hücre sıralama olmadan iyi tanımlanmış, hızlı, tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve ucuz bir yöntem melanosit veya melanosit öncüleri içine hPSCs (isteğe bağlı veya embriyonik) ayırt etmek araştırmacılar sağlar. protokol pigmentasyon bozukluğu olan hastaların iPSCs ayırt zaman hastalığa özgü kusurları tespit etmek, daha önce kullanıldı.
Protocol
Representative Results
Discussion
hPSCs gelen melanosit başarılı farklılaşması için aşağıdaki önerileri dikkate alınmalıdır. İlk ve en önemlisi, her zaman steril kültür koşulları altında çalışmak için gereklidir. Buna ek olarak, pluripotent tam farklılaşmamış hPSCs ile başlamak için önemlidir; Başlangıç nüfus farklılaşmış hücreleri içeriyorsa verimi kaçınılmaz kirletici melanosit yönelik edilemez ve hatta daha düzgün ayırt hücreleri bozabilir olarak düşecek.
Hücreler…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Joanna M. Nicolay Vakfı melanom araştırmacılar için bir burs ile ve Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü F31 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma ayrıca NYSTEM ve Tri-kurumsal kök hücre girişimi (Starr Vakfı) hibe yoluyla destek verdi.
Materials
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133–032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032g in 100ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
Referenzen
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
- Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
- White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
- Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
- Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
- Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
- Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
- Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064 (2011).
- Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
- Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
- Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
- Zur Nieden, N. I. . Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , (2011).
- Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).
