인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도
Summary
이 작품은 신경 능선을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 색소, 성숙한 멜라닌 세포를 생산하고 공급이없는 25 일간의 프로토콜을 사용하여 중간 단계 멜라닌하는 체외 분화 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.
Introduction
인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)은 질병 모델링, 약물 스크리닝, 세포 대체 요법 1-6 대한 확장 형태로 정상적인 분화를 모방하는 플랫폼을 제공한다. 특히 관심, hPSCs은 분리하기 어렵거나 환자 샘플이 부족하다 희귀 / 과도 세포 유형 공부 길을 엽니 다. 또한, 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 고유의 메커니즘 1,2,7-11을 해명하기 위해 환자 특정 방식으로 개발 및 질병 모델링을 연구하는 연구자 수 있습니다. hPSCs에서 멜라닌 세포의 분화 이전에 발행 된 프로토콜은 차별화 6 주 정도가 필요하며 L-Wnt3a 세포 (12)로부터의 조건화 된 배지로 배양 세포를 포함한다. 이 프로토콜은 처음 운모 등 제시.과 설명 여기에 3 주 색소 세포를 생산하고 모호함과 컨디셔닝 매체와 관련된 불일치를 제거합니다.
멜라닌 세포 아칸소신경 크레스트, 척추 동물에 고유 한 세포의 이주 인구에서 파생 된 전자. 신경 크레스트 낭배 동안 정의 신경 및 비 신경 외배엽 간의 접경 신경 판의 가장자리 세포 집단을 나타내고있다. neurulation 동안, 신경 조직은 신경 튜브 13, 14의 결과 지느러미 중간 선에서 수렴 신경 주름을 형성 신경 판에서 진화.
신경 능선 세포는 척색 맞은 편에 신경 튜브의 지붕 판에서 등장하고 분화 된 세포의 다양한 인구 증가를 제공 멀리 이주하기 전에 중간 엽 전이에 상피를 받아야. 크레스트 세포의 운명은 배아 체 축을 따라 지붕 판의 해부학 적 위치에 의해 부분적으로 정의된다. 신경 능선 세포 유도체 모두 중배엽 계통의 특성 (평활근 세포, 골아 세포, 지방 세포, 연골 세포) 및 외배엽 세포를 포함한다 (멜라닌 세포, 슈반 CELL 학생, 뉴런) 14. 신경 크레스트 줄기 세포는 전사 인자 SOX10을 상향 조절 및 P75 및 HNK1에 대한 항체로 정렬 형광 활성화 세포에 의해 분리 될 수있다.
멜라닌 세포가 멜라닌 단계를 통과 6,21 MITF은 멜라닌 세포 개발의 마스터 레귤레이터 및 전사 인자가 멜라닌 세포 개발의 많은 부분을 제어해야하는 KIT와 MITF (소안 구증 관련 전사 인자)를 상향 조절 될 운명 신경 능선 세포 22- 24. 인간 melanoblasts는 머리 팽창 또는 표피에서 각질 형성 세포에 의해 둘러싸여 성숙, 멜라닌 색소에 대한 전구체로서 기능 할 (색소 형성 단위) 중있는 표피의 기저층에 이동한다. 착색 멜라닌 세포에 melanoblasts의 분화와 성숙은 머리 전구의 식민지와 표현 멜라닌 생성 경로 (TYRP1, TYR, OCA2와 함께 수반 발생PMEL) 25, 26.
환자에서 인간의 멜라닌 세포와 melanoblasts을 분리하는 것은 비용이 어렵고 수량에 제한입니다. 이 프로토콜은 셀 정렬없이 잘 정의 된, 신속하고, 재생 가능한 확장 성, 저렴한 방법으로 멜라닌 세포 또는 멜라닌 세포 전구체에 hPSCs을 (유도 또는 배아) 구별하기 위해 연구자 수 있습니다. 프로토콜은 색소 질환 환자 iPSCs 차별화 때 질병 특정한 결함을 식별하는 데 이전에 사용 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
hPSCs에서 멜라닌의 성공적인 분화 다음 방법이 고려되어야한다. 무엇보다도, 항상 무균 배양 조건에서 동작하는 것이 필수적이다. 또한,이 다 능성 완전히 분화 hPSCs 시작하는 것이 중요하다; 시작 인구가 분화 세포를 포함하는 경우 수익률은 변함없이 오염 물질이 멜라닌 세포 지향 할 수 없으며 더욱 제대로 분화 세포를 방해 할 수 있으므로 삭제합니다.
세포가 만능 줄기 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 조안나 M. NICOLAY 재단 흑색 종 연구를위한 친교에 의해 루스 L. Kirschstein 국가 연구 서비스 상 F31에서 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 지원되었다. 이 작품은 더 NYSTEM 및 트라이 기관 줄기 세포 이니셔티브 (스타 재단)에서 보조금을 통해 지원되었다.
Materials
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133–032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032g in 100ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
Referenzen
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