Упрощенный метод для сверхнизкой плотности, Долгосрочное Первичный гиппокампа Нейрон культуры

Рост гиппокампа нейронов в условиях , в пробирке позволяет вести наблюдение и экспериментальные манипуляции этих нейронов, которые в противном случае не представляется возможным в естественных условиях. Этот экспериментальный подход широко используется для выявления нейронные механизмы роста, полярности, спецификации аксонов, торговлей и внутриклеточной локализации белков, формирование синапсов и функционального созревания ^1. Эти в пробирке культивированный нейронов гиппокампа, когда собирали из поздних эмбриональных стадий, относительно чистый (> 90%) глутаматергические клетки пирамидальной морфологии ^2. Поскольку нейроны выращивали в поверхности 2-D в условиях , в пробирке, этот метод позволяет легко наблюдать, например, живого изображения или иммуноцитохимию (ICC) окрашиванием через единый фокальной плоскости ^3; или манипуляции, такие как медикаментозное лечение и трансфекциях ^3-6. При выращивании при высокой плотности, нейроны, как правило, имеют высокие показатели выживаемости из-за более высокого сотрудничестваncentrations секретируемых факторов роста в дополнение к алиментарной поддержки со стороны средств массовой информации роста, а также из – за аксонов контакт-зависимые механизмы ^7. Тем не менее, низкая плотность нейронов гиппокампа являются желательными для морфологических исследований, где отдельный нейрон может быть отображенных в полном объеме или окрашенными для анализа ICC. Нейроны низкой плотности трудно поддерживать в культуре из – за отсутствия поддержки паракринной и , таким образом , часто требуют трофической поддержки со стороны глиальных ( как правило , коркового астроцитов) фидерного слоя, который должен быть подготовлен до нейрон культуры ^2. При культивировании совместно с глиальной фидерного слоя клеток, нейронов низкой плотности выращивают на покровных стеклах, а затем переворачивается на вершине глии слоя таким образом, что нейроны низкой плотности и глии обращены друг к другу. Небольшое ограниченное пространство между глии и нейронов создается путем размещения парафиновые точки на углах покровные, создавая тем самым «сэндвича» макет ^2,8,9. Нейроны низкая плотность будет расти шithin ограниченного пространства между глии и покровного, что создает разрешительный микросреду с концентрированными факторами, выделяемыми нейронов и глии. Такой подход позволяет получить низкую плотность, полностью развитые нейроны, которые отстоят друг от друга достаточно, поэтому маркировку, облегчающую ICC или исследования живого изображения.

Очевидным недостатком нейрон-глиальных сокультивирования, помимо того, что отнимает много времени и трудоемким, является то, что он предотвращает исследование нейрон-специфический, или клеточно-автономными, механизмы. Хотя эта система является гораздо менее сложной , чем в естественных условиях нервной ткани, воздействие глии на развитие нейрон через секретируемых, пока еще не полностью определенных факторов могут посрамить эксперименты ^10. Таким образом, в экспериментах, которые требуют изучения конкретных механизмов нейрон, определенные условия культивирования, которые удаляют сыворотку и глиальных слой подложки необходимы. Предыдущее исследование удалось культивировании низкие концентрации нейронов (~ 9000 клеток / см ²⁾ , используя юРЗЭ мерная матрица гидрогеля ^11. Так как относительно чистый нейрональной популяции можно культивировать при высокой плотности при бессывороточной условиях без глии, мы предполагаем, что сверхнизкой плотности нейронов гиппокампа можно выращивать в не содержащей сыворотки определяется культуральной среды путем совместного культивирования их с нейронами с высокой плотностью, в путь, который является аналогом традиционно принятой нейрон-глии сокультивирования. Действительно, высокая плотность гиппокампа нейрон культур в конфигурации «сэндвича» были недавно использованы для поддержки небольшого количества специализированных КРУПНОКЛЕТОЧНЫХ эндокринных нейронов ^12.

Таким образом, совместное культивирование с нейронами высокой плотности может позволить нейроны с низкой плотностью, чтобы получить коэффициенты трофической поддержки, которая достаточна для того, чтобы на долгосрочное выживание. Этот протокол нейронов культивирования сверхнизкой плотности, таким образом, сформулирована и утверждена. Протокол может быть реализован в одном эксперименте, подготовив высокой плотности (~ 250000 клеток / мл) ЦСИsociated нейроны гиппокампа, а затем сделать разбавление , чтобы получить плотность ~ 10000 нейронов / мл (~ 3000 нейронов / покровное, или ~ 2000 нейронов / см ^2), что значительно ниже , чем у большинства сообщалось культур низкой плотности ^{2,3,9 , 11,13.} Это состояние культуры свободно упоминается как культура "ультра-низкой плотности" и используется с "низкой плотности" интер-непостоянно. Нейроны высокой плотности высевают на поли-D-лизин покрытием 24-луночных планшетах; в то время как нейроны с низкой плотностью высевают на поли-D-лизин покрытием покровные стекла 12 мм, которые размещены внутри другой 24-луночный планшет. Покровные с соблюдением нейронами низкой плотности перевернуты на вершине нейронов высокой плотности 2 ч спустя после того, как нейроны происходят и прикреплены к покровные. Кроме того, вместо того чтобы использовать парафиновые точки, чтобы поднять покровные над нейрон слоя высокой плотности, шприц иглой 18 G использовали травление в нижней части 24-луночные планшеты с двумя параллельными полосами. Полученный DisplACED, примыкающие пластмассы обеспечивают повышенную поддержку покровные стекла. Это пространство последовательно измеряется при 150-200 мкм, что позволяет достаточно кислорода и культуральной среды, обеспечивая при этом обмен микросреду с концентрированными трофических факторов. При выполнении этого условия, нейроны низкая плотность растут интенсивно, и может выжить после трех месяцев в культуре. Когда эти нейроны трансфицировали плазмидой GFP через три недели в культуре, дендриты обильно усеяна дендритных шипиков. В качестве доказательства принципа, приведены данные, чтобы показать, что эта система совместно культуры поддерживает сверхнизкие культур плотности нейронов гиппокампа, посеянных на поли-D-лизином 'микро-островков », где нейроны образуют autaptic соединения, которые могут облегчить исследование клетки -autonomous, сетевые независимые механизмы.