التحضير للثقافات الجرذ دبقية قليلة التغصن السلف والكمي لOligodendrogenesis عن طريق ثنائي الأشعة تحت الحمراء الضوئي الإسفار
Summary
Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.
Abstract
Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.
Introduction
التوصيل العصبي فعال في الجهاز العصبي المركزي الثدييات (CNS) يتطلب تكون الميالين من المحاور التي كتبها قليلة التغصن. خلال التنمية، تنشأ قليلة التغصن من بين مجموعة من خلايا دبقية قليلة التغصن السلف (يجد OPCs) التي يعتقد أن الهجرة من مناطق البطين من الدماغ الأمامي تطوير والأنبوب العصبي 1. بعد تفرق يجد OPCs الهجرة إلى ناضجة، قليلة التغصن myelinating التي تسهل كفاءة نشر الدافع ليس فقط، ولكن أيضا توفير محاور مع الدعم الغذائي 2. يحافظ على الجهاز العصبي المركزي الكبار أعداد وفيرة من يجد OPCs المنتشرة في جميع أنحاء المادة الرمادية والمادة البيضاء التي تضم حوالي 5-8٪ من جميع الخلايا 3. بعد إهانة المزيل، يجد OPCs تهاجر إلى موقع الإصابة، تتكاثر، والتفريق ليحل محل الأغماد المايلين المفقودة أو التالفة على المحاور المكشوفة. ومع ذلك، في بعض البيئات مرض / إصابة، تم العثور على هذه العملية أن تكون غير فعالة أو يمكن أن تفشل تماما 4. في حينويعتقد إزالة الميالين المزمن إضافة إلى عبء المرض، oligodendrogenesis كفاءة وعودة الميالين قد تخفف من أعراض 5. فقد كان لذلك من مصلحة لدراسة يجد OPCs في المختبر لتحديد تأثير العوامل التجريبية على oligodendrogenesis.
أحرز التبصر في مراحل مختلفة من التمايز دبقية قليلة التغصن ممكن عن طريق تحديد مرحلة علامات معينة من الخلايا. وتعرف الخلايا الاولية في وقت مبكر تجديد الذات من قبل التعبير عنها الصفيحات المستمدة عامل النمو مستقبلات ألفا (PDGFRα)، العصبية / الدبقية مستضد 2 (NG2) وA2B5 6-8. كما تبادر يجد OPCs برنامج التمايز وتنسحب من دورة الخلية، فإنها downregulate التعبير عن هذه العلامات والبدء في التعبير عن البروتينات الإرشادية للpremyelinating قليلة التغصن بما في ذلك دائرى-النوكليوتيدات 3'-فسفودايستراز (CNPase) وO4. وأخيرا، والتمايز بهم إلى oligodendroc أكثر نضجايتميز ytes عن طريق التعبير عن البروتينات المرتبطة المايلين، بما في ذلك بروتين سكري المرتبطة المايلين (MAG)، بروتين شحم بروتيني (حزب العمال التقدمي)، والبروتين الأساسي المايلين (ب ب). MBP هو داخل الخلايا الطرفية بروتين الغشاء وعنصرا رئيسيا من غمد المايلين. الفئران التي تفتقر MBP تطوير النمط الظاهري حاد في الجهاز العصبي المركزي والتي تكون الميالين وانخفضت بشكل ملحوظ مما يؤدي إلى هزات، والتشنجات والموت المبكر 9،10. وقد أدى هذا الدور الهام للMBP في الميالين إلى استخدامه كعلامة للتمييز دبقية قليلة التغصن على حد سواء في التجارب المختبرية والحية 11.
الكمي لMBP يمكن تحقيقه باستخدام عدة أساليب مختلفة. RT-PCR وتحليل لطخة غربية تسمح لتقدير مستويات MBP تحت نظم العلاج المختلفة. مناعية هو نهج نوعي المشترك الذي يمكن أيضا أن تكون الكمية عندما تستخدم نهج المجهري القائم على الكاميرا. على الرغم من أن هذه الأنظمة هي موثوق بها والأساسية لدراسة التمايز دبقية قليلة التغصن، ولكل من عيوبها الخاصة التي تحد من استخدامها في فحص المخدرات. أولا، كمية من يجد OPCs الأولية أن هناك حاجة لRT-PCR وتحليل لطخة غربية يقلل من عدد من المتغيرات التي يمكن دراستها في وقت واحد. في حين أن الشرط خلية للمناعية أقل من ذلك بكثير، يجب أن تخصص وقت كبير لكل تجربة إذا الكمي هو الهدف. يجب أن يتم القبض على العديد من الصور وبعد ذلك كميا لتسهيل التحليل التجريبي. تصبح هذه المحاذير العقبات الهامة التي يجب مراعاتها للدراسات التي تتطلب تقييم إنتاجية عالية. نحن هنا تصف طريقة التي تستخدم الجوانب الأساسية من كل من مناعية والمنهجيات لطخة غربية لتقدير المايلين، في حين أن الحد بشكل كبير كل من عدد الخلايا المطلوبة والوقت لاستكمال التحليل الكمي.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول المعروضة هنا يصف طريقة سريعة وموثوق بها لعزل يجد OPCs الفئران وقياس في oligodendrogenesis المختبر استجابة لعوامل التجريبية. عن طريق اختيار إيجابية، وتستخدم عوائد عالية من يجد OPCs قابلة للحياة ونقية مباشرة لأغراض تجريبية. هذه الطريقة يبسط العزلة، زراعة، والخ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
منح الراعي: المعاهد الوطنية للصحة. منحة رقم: R37 NS041435.
Materials
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1 x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 mL |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/mL |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/mL |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/mL |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/mL |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/mL |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/mL |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/mL |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1 x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1 x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1 x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1 x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor | ||
Referenzen
- Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
- Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
- Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
- Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
- Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
- Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
- Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
- Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
- Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
- Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
- Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
- Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
- O’Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
- Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
- Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).
