Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Os gliomas são uma classe de cancros cerebrais gliais que derivam de células gliais transformadas dentro do sistema nervoso central (SNC). De todos os gliomas, Organização Mundial da Saúde (OMS) glioma grau IV ou glioblastoma (GBM), é o mais comum e letal ^1. GBM é altamente refractário ao tratamento padrão-de-curso que consiste na ressecção do tumor na medida do possível, seguida por radiação, mais quimioterapia concomitante e adjuvante com temozolomida ^2. Estes cancros mortais transportar um prognóstico sombrio de apenas 15-18 meses de sobrevivência a partir do momento do diagnóstico inicial com apenas 5% dos pacientes que sobrevivem a doença depois de 5 anos ^3.

A presença da barreira hematoencefálica (BHE), a falta de células apresentadoras de antigénios profissionais (APCs), e a existência de estruturas previamente não identificado linfáticos bona fide dentro do cérebro ⁴ conduziram à noção de GBM como imune privilegiada. No entanto, numerosos estudos agora shoW que estes cancros cerebrais, de facto geram o recrutamento de células imunitárias periféricas que são predominantemente de origem mielóide, que incluem monócitos, macrófagos e células supressoras derivadas de mielóides ^(MDSCs) 5. GBM também influencia a atividade de microglia cérebro-residente para se tornar pró-tumorigenic ^6,7. As células linfóides, tais como as células ^T CD8 + ⁸ e células CD56 ⁺ assassinas naturais ⁹ também estão presentes dentro do microambiente do tumor, mas em muito menor número, um facto provavelmente devido à função imunossupressora instigada por factores derivadas de glioma em macrófagos associados a tumores ( TAM) ^{10. Células} T CD4 + também estão presentes no GBM, mas grande parte dessa população também expressa CD25 e FoxP3, fabricantes de imunossupressora T reguladoras _(reg T) as células ^11. O estado imunossupressora total do GBM culmina com a promoção da fuga imunológica e progressão tumoral ^12.

<p class= "jove_content"> Uma melhor compreensão dos mecanismos de GBM imunossupressão é crítico para o desenvolvimento de estratégias eficazes imunoterapêuticas concebidas para estimular o sistema imunitário contra o tumor. Ao longo dos últimos 15 anos, nosso laboratório tem trabalhado para superar os mecanismos do cérebro immunosuppresson tumor, a fim de desenvolver novas immunotherapeutics eficazes anti-GBM ^13-19. O culminar deste trabalho tem levado a um ensaio clínico destinado a avaliar um citotóxico combinada e terapêutica imuno-estimulante para os pacientes com diagnóstico recente de GBM (ClinicalTrials.gov Identificador: NCT01811992).

O nosso trabalho mais recente mostra que o GL26 de ratinho e rato de CNS-1 células GBM bloquear antitumoral vigilância imunitária das células NK através da produção de grandes quantidades de a lectina de ligação a β-galactósido galectina-1 (Gal-1) ^20. Isto foi demonstrado através da supressão da expressão de Gal-1 em células de glioma de knockdown utilizando shRNA gene mediada. In vitro experiments mostraram que as células de glioma Gal-1 deficiente proliferaram normalmente na cultura, no entanto, sofreu rejeição rápida logo após o enxerto intracraniana em sing�ico C57BL / 6J ou RAG1 ^{– / – ratos,} estabelecendo assim a independência do T ou células B sobre esta forma de rejeição de tumor. Imunodepleção de células NK com anticorpos anti-asialo _GM-1 anti soro ou anticorpos monoclonais NK1.1 conduziram à recuperação completa do crescimento de glioma Gal-1-deficiente intracraniana, estabelecendo o papel das células NK em Gal-1-deficiente rejeição glioma. Mostramos agora que imunodepleção de células mielóides Gr-1 ⁺ / CD11b ^{+ é} suficiente para impedir que o glioma rejeição Gal-1-deficiente apesar da presença de células NK, revelando assim um papel auxiliar indispensável para células mielóides no favorecimento de Gal NK mediada lise tumoral -1 com deficiência (dados não publicados). Este resultado inesperado nos levou a desenvolver um protocolo abrangente para o isolamento e análise de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), queinfiltrar no microambiente do tumor cerebral logo após o enxerto intracraniana para que possamos melhor caracterizar os eventos de infiltração do sistema imunológico que predicado glioma rejeição gal-1-deficiente.

O método é demonstrado aqui, usando células de glioma do rato GL26 que a proteína fluorescente mCitrine constitutivamente expresso, chamado GL26-Cit, que permitem a visualização de células tumorais direta por microscopia de fluorescência ^21. Estas células são enxertados estereotacticamente no cérebro de singeneicos C57BL / 6J e são deixadas a crescer durante 24, 48, ou 72 horas antes do rato eutanásia. PBMC infiltrantes de glioma são então isolados e immunolabeled usando anti -CD45, -GR-1, -CD11b -NK1.1 e anticorpos de superfície da célula, juntamente com imunomarcação intracelular para a granzima B (GzmB). Esta combinação específica de anticorpos permite a identificação de ^Gr-1 + / ⁺ CD11b células mielóides infiltrantes tumorais e NK1.1 ^+, células NK, os tipos de células que temos been implicados na rejeição de tumor Gal-1-deficiente. O perfil imunológico infiltração de Gal-1-deficiente GL26-Cit glioma, referido aqui como GL26-Cit-gal1i, é então comparada com a de gliomas que expressam níveis normais de Gal-1 chamado GL26-Cit-NT que contêm uma não- segmentação controle hairpin shRNA. O protocolo começa com uma descrição de como a cultura de células de glioma GL26-Cit in vitro, que é seguido por uma explicação sobre como ortotopicamente enxertar essas células para o corpo estriado de sing�icos camundongos C57BL / 6J. Em seguida, prossegue para enumerar as etapas envolvidas no isolamento e imunomarcação de PBMCs infiltrantes de glioma para análise de citometria de fluxo. O protocolo termina com uma explicação de análise de dados padrão e representação gráfica.

A demonstração revela que tanto a Gr-1 ⁺ / ⁺ CD11b células mielóides e células NK NK1.1 ⁺ preferencialmente se acumular dentro do microambiente do tumor cerebral Gal-1-deficiente dentro 48hr de implantação do tumor, um resultado que ajuda a explicar por que esses tumores rapidamente sofrer lise tumoral completa aproximadamente 1 semana enxerto pós-tumoral ^20. O método é facilmente adaptável a um número de diferentes modelos experimentais in vivo em que os dados temporais de infiltração imune no cérebro é necessária. Uma única experimentalista podem executar o protocolo de colheita cérebro para análise citométrica de fluxo de PBMCs infiltrantes de glioma em cerca de 4-6 horas, dependendo do número de amostras a serem analisadas. O método pode também ser combinado com experiências destinadas para caracterizar o perfil de PBMCs em circulação em ratinhos portadores de tumor em comparação com aqueles que se infiltrar no cérebro, de forma a identificar os fenótipos imunossupressão especificamente induzidas pelo microambiente do tumor. Aplicação desta e de semelhantes métodos deverá facilitar uma melhor compreensão dos fatores envolvidos no tráfico de células imunes periféricas no microambiente do tumor cerebral.