Imagem raciométrica de pH extracelular no biofilme dentário

O método descrito aqui permite a monitorização do pH extracelular em biofilmes dentais na gama entre 4,5 e 7, utilizando o corante raciométrica seminaphthorhodafluor 4F-5- (e-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4), em combinação com a microscopia de varrimento a laser confocal e análise de imagem digital. O corante fluorescente empregue é sensível ao pH e exibe uma mudança na sua emissão fluorescente, dependendo do estado de protonação. A emissão fluorescente dos picos de moléculas protonadas a 580 nm, e a emissão da molécula desprotonado em 640 nm ^1. A razão entre as intensidades de emissão fluorescente em duas janelas de detecção que compreende os dois picos de emissão (576-608 nm e 629-661 nm) reflecte, portanto, o pH na fase líquida, independentemente da concentração de corante. Com um valor _de pKa de 6,4 ~ o corante é adequado para visualização em ambientes de pH moderadamente ácidas.

PH no biofilme bacteriano é de importância central para todos os processos metabólicos.No caso de biofilmes dentais, o pH na matriz extracelular é o factor de virulência chave para o desenvolvimento de cárie dentária. Longos períodos com pH baixo na liderança interface de biofilme-tooth para retardar a desmineralização do esmalte subjacente ^2. Devido à arquitectura tridimensional complexa de biofilmes, metabolitos, incluindo os ácidos orgânicos, não são uniformemente distribuídos através do biofilme. Altamente e menos microambientes acidogênicas pode ser encontrada em estreita proximidade espacial ^3.

Durante décadas, os gradientes de pH verticais em biofilmes foram gravadas com a ajuda de microeletrodos ^4-6. Enquanto eles oferecem uma boa resolução espacial devido ao seu tamanho pequeno ponta, eles não são adequados para monitorar gradientes horizontais. Além disso, a inserção do eléctrodo perturba o biofilme mecanicamente. técnicas microscópicas fluorescentes quantitativos oferecem a vantagem de visualizar mudanças de pH em diferentes áreas de um biofilme sem interferir mecânicance. Diferentes campos de vista microscópico pode ser escolhido livremente e fotografada várias vezes ao longo de períodos prolongados ^1,7-9. No entanto, ao interpretar imagens microscópicas de biofilme, é importante fazer a distinção entre a fluorescência derivada da biomassa microbiana e a fluorescência resultante a partir do espaço extracelular. Em condições acídicas, o pH no interior das células bacterianas é diferente do pH na matriz extracelular, como as bactérias transportar activamente protões através sua membrana celular à custa de adenosina trifosfato ^10. No contexto da cárie dentária, pH bacteriana intracelular não tem um impacto direto sobre o esmalte subjacentes enquanto baixo pH extracelular leva a desmineralização. Média de pH em imagens microscópicas que contêm ambas as áreas e bactérias livres de bactérias leva a resultados errados. A utilização de outras manchas, juntamente com o corante sensível ao pH, a fim de visualizar a biomassa bacteriana e diferenciar entre as áreas extra e intracelulares traz abo risco de contaminação de fluorescência do espaço extracelular e erros de medição ^11.

Por conseguinte, o presente manuscrito descreve a utilização do corante raciométrica numa função dupla; tanto como um marcador de pH e como uma mancha universal de bactérias. Como o corante é-se concentrado em células bacterianas, a combinação de imagem microscópica confocal e um processo de análise de imagem digital preciso permite determinar o pH extracelular no intervalo entre 4,5 e 7,0 em biofilmes finos dentários.