Un test PCR Duplex numérique pour simultanée Quantification de la<em> Enterococcus spp.</em> Et le HF183 marqueur humain Fecal associé dans les eaux
Summary
Ce manuscrit décrit un essai PCR duplex numérique qui peut être utilisé pour quantifier simultanément Enterococcus spp. , Et les marqueurs génétiques HF183 comme indicateurs de contamination fécale générale et humaine associée dans les eaux récréatives.
Abstract
Ce manuscrit décrit un test de PCR numérique duplex (EntHF183 RCPH) pour la quantification simultanée de Enterococcus spp. Et le marqueur humain HF183 fécale associée. Le EntHF183 duplex RCPH (dénommé EntHF183 RCPH de maintenant) test utilise les mêmes amorces et sondes séquences que ses PCR quantitative (qPCR) homologues individuels publiés. De même, les mêmes procédures de filtration d'eau et d'extraction d'ADN effectuée avant qPCR sont suivies avant d'exécuter RCPH. Cependant, le dosage duplex DPCR présente plusieurs avantages par rapport aux essais de qPCR. Plus important encore, le dosage RCPH élimine la nécessité d'exécuter une courbe standard et donc, le biais et la variabilité associée, par quantification directe de ses objectifs. En outre, alors que duplexage (c. -à- quantification simultanée) Enterococcus et HF183 en qPCR conduit souvent à une sous – estimation grave de la cible moins abondante dans un échantillon, RCPH fournit une quantification cohérente des deux cibles, aiguisentelle quantifié individuellement ou simultanément dans la même réaction. Le dosage DPCR est également capable de tolérer des concentrations d'inhibiteur de PCR qui sont un à deux ordres de grandeur plus élevées que celles tolérées par qPCR. Ces avantages font l'essai EntHF183 RCPH particulièrement intéressante, car elle fournit simultanément des informations précises et reproductibles à la fois sur la contamination générale et humaine associée fécale dans les eaux environnementales sans la nécessité d'exécuter deux essais qPCR séparés. En dépit de ses avantages sur qPCR, la limite de quantification supérieure du dosage RCPH avec instrumentation disponible actuellement est d'environ quatre ordres de grandeur inférieure à celle obtenue par qPCR. Par conséquent, la dilution est nécessaire pour la mesure des concentrations élevées d'organismes cibles, tels que ceux qui sont habituellement observés à la suite de déversements d'eaux usées.
Introduction
Les méthodes quantitatives PCR (qPCR) ont été largement utilisés à des fins récréatives surveillance de la qualité de l'eau et microbiennes des applications de suivi de la source, car ils sont plus rapides, plus flexibles et spécifiques par rapport aux méthodes basées sur la culture traditionnelle. Par conséquent, qPCR est recommandé pour obtenir des résultats de surveillance des eaux rapides des indicateurs fécaux généraux tels que Enterococcus spp. , Dans la version révisée de l' EPA eau récréative des critères de qualité 1. De nombreux essais qPCR ont également été mis au point et validé pour identifier les sources de contamination fécale dans les eaux environnementales 2. Parmi ceux – ci, le dosage des marqueurs HF183 sont parmi les plus fréquemment utilisés pour identifier la contamination fécale 3 humaine associée.
Cependant, les résultats de qPCR peuvent souvent être biaisés car elles reposent sur des courbes standards pour la quantification. qPCR quantifie concentrations inconnues de cible dans les échantillons par interpolation de leur cycle de quantification (Cq) à partir d'un stancourbe de norme qui décrit une relation linéaire entre Cq et la quantité logarithmique d'un ensemble de normes en série dilué. Le manque de matériel de référence standard fiable et cohérente peut donc fausser considérablement les résultats de qPCR. Des études ont montré que les résultats de qPCR différaient d'environ un demi – log en utilisant des normes de différents fournisseurs et 4 par 2 fois en utilisant différents lots de normes du même fournisseur 5.
PCR (RCPH) La technologie numérique quantifie un échantillon inconnu en comptant la fréquence des points positifs dans un grand nombre de RFP miniatures qui sont générés par le partitionnement d' un qPCR en vrac dans des milliers ou des millions de nanolitre uniforme ou réactions picolitres 6. Il est mentionné que gouttelette PCR numérique (c. -à cet article) ou une chambre PCR numérique, respectivement, si les partitions sont des gouttelettes d' eau dans l'huile ( par exemple, cet article) ou de petites chambres sur une puce. Une concentration plus élevée de l'échantillon se traduira par la présence de l'ADN cible(PCR donc positif) dans une proportion plus élevée de partitions, une relation approchée par la loi de Poisson. En tant que tel, les résultats binaires (PCR positive ou négative) sont enregistrées et la fréquence de gouttelettes positives sont utilisées pour calculer les concentrations d'échantillons inconnus directement par approximation de Poisson, ce qui élimine la nécessité d'une courbe standard comme dans qPCR.
Cette nature binaire de quantification par PCR numérique offre des avantages supplémentaires sur qPCR 7. Parce que l'amplification retardé peut encore obtenir une PCR positive RCPH quantification est plus robuste contre l'inhibition qui réduit l'efficacité de l'amplification. De même, RCPH quantification ne soit pas affectée par la variabilité des valeurs Cq comme est qPCR, conduisant à une plus grande précision de RCPH par rapport à qPCR 8-10.
En outre, le procédé de séparation assure une très petite quantité d'ADN cible présente dans chaque goutte, ce qui réduit efficacement la concurrence du substrat (pendant amplification des différentes cibles d'ADN) qui sont des obstacles communs à la réalisation de duplexage (ie un test mesure simultanément deux cibles d'ADN) dans qPCR. En tant que tel, si l' exécution en duplex ou simplex (ie une cible est mesurée en un seul essai) RCPH produit quantification presque indiscernables des deux cibles 7,11.
Le but du test de PCR numérique (EntHF183 RCPH) décrit dans cet article est d'obtenir une quantification directe simultanée de l'indicateur fécal général Enterococcus spp. Et le marqueur HF183 humain-fécale associée à une précision améliorée, la reproductibilité et la robustesse contre l' inhibition par rapport à son qPCR homologues. Ce test a été utilisé avec succès pour quantifier la contamination fécale dans l' eau douce de l' environnement, l' eau de mer, et diverses matières fécales 7, mais peut également être appliquée à d'autres types d'eaux et des eaux usées. Ce test est très prometteur pour l'analyse de sédiments ou des sols en raison de sons grande tolérance à l'inhibition, mais des tests supplémentaires sont nécessaires en raison de la complexité du mélange inhibiteur dans ces types d'échantillons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a quelques étapes critiques dans le protocole. Tout d'abord, le mélange des mélanges d'essai peut être difficile parce que le mélange maître est plus visqueux que les mélanges maîtres qPCR classiques. tourbillonnement simple peut conduire à un mélange insuffisant, ce qui à son tour conduit à une distribution non uniforme des matrices d'ADN dans les mélanges d'essai, puis dans les gouttelettes. La technique de mélange par pipetage décrit dans le protocole doit être suivi pour assurer …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20uL pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200uL pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E.faecalius genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalius and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
Referenzen
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