Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de<em> Enterococcus spp.</em> En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters
Summary
Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR test die kan worden gebruikt om tegelijkertijd kwantificeren Enterococcus spp. En HF183 genetische merkers als indicatoren van algemene en menselijke-geassocieerde fecale besmetting in recreatiewater.
Abstract
Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR-test (EntHF183 dPCR) voor gelijktijdige kwantificering van Enterococcus spp. En het menselijk fecal-geassocieerde HF183 marker. De EntHF183 duplex dPCR (aangeduid als EntHF183 dPCR hierop) test gebruikt dezelfde primer en probe sequenties zijn gepubliceerd individuele kwantitatieve PCR (qPCR) tegenhangers. Ook worden dezelfde waterfiltratie en DNA extractie procedures uitgevoerd voorafgaand aan qPCR vóór loopt dPCR gevolgd. De duplex dPCR assay heeft verscheidene voordelen boven de qPCR assays. Het belangrijkste is de dPCR test overbodig uitvoeren van een standaardcurve en dus de bijbehorende voorspanning en variabiliteit, door directe kwantificering van de doelen. Bovendien, terwijl dubbelzijdig (dwz gelijktijdige kwantificering) Enterococcus en HF183 in qPCR vaak leidt tot ernstige onderschatting van de minder overvloedig doelwit in een monster, dPCR consistent kwantificering van beide doelstellingen slijpenhaar afzonderlijk of gelijktijdig gekwantificeerd in hetzelfde reactievat. De dPCR assay kan ook PCR remmerconcentraties die 1:59 orden van grootte hoger dan die getolereerd door qPCR worden geduld. Deze voordelen maken het EntHF183 dPCR assay bijzonder aantrekkelijk omdat het tegelijkertijd zorgt voor een nauwkeurige en reproduceerbare gegevens over algemene en humaan-geassocieerde fecale verontreiniging aard in water zonder de noodzaak om twee afzonderlijke qPCR assays werking. Ondanks de voordelen ten opzichte qPCR, de bovenste grens van de kwantificering dPCR assay met de huidige instrumentatie ongeveer vier orden van grootte lager dan die welke door qPCR. Bijgevolg is verdunning noodzakelijk voor het meten van hoge concentraties doelorganismen zoals typisch waargenomen na rioolwater morsen.
Introduction
Kwantitatieve PCR (qPCR) methoden zijn op grote schaal gebruikt voor recreatieve monitoring van de waterkwaliteit en microbiële bron tracking-toepassingen, omdat ze sneller, flexibeler en specifiek in vergelijking met de traditionele cultuur-gebaseerde methoden. Bijgevolg qPCR wordt aanbevolen voor de verwezenlijking van snelle water monitoringsresultaten voor algemene fecale indicatoren zoals Enterococcus spp. In het herziene USEPA recreatiewater kwaliteitscriteria 1. Vele qPCR assays zijn ontwikkeld en gevalideerd voor het identificeren van bronnen van fecale verontreiniging aard in water 2. Een daarvan is de HF183 marker assays zijn de meest vaak gebruikt voor het identificeren van menselijke fecale verontreiniging geassocieerde 3.
Toch kan qPCR resultaten vaak een vertekend beeld geven, omdat ze vertrouwen op de standaard curves voor de kwantificering. qPCR kwantificeert onbekende concentraties van het doel in monsters door interpolatie van hun kwantificering cyclus (Cq) uit een standaard curve die een lineair verband tussen Cq en logaritmische hoeveelheid van een reeks serieel verdunde standaarden beschrijft. Gebrek aan betrouwbare en consistente standaard referentiemateriaal kan dus sterk vertekening qPCR resultaten. Studies toonden aan dat qPCR resultaten verschilden ca. ½ log behulp standaarden van verschillende leveranciers 4 en 2 maal met verschillende batches van standaarden van dezelfde leverancier 5.
Digitale PCR (dPCR) technologie kwantificeert een onbekend monster door het tellen van de frequentie van treffers bij grote aantallen miniatuur PCRs die worden gegenereerd door het verdelen van een bulk qPCR in duizenden of miljoenen uniform nanoliter of picoliter 6 reacties. Het wordt aangeduid als druppel digitale PCR (dwz dit artikel) of kamer digitale PCR, respectievelijk, indien de schotten in water-in-olie druppeltjes (dwz dit artikel) of kleine kamers op een chip. Een hogere concentratie van het monster zal resulteren in aanwezigheid van doel DNA(Vandaar positieve PCR) in een groter deel van de scheidingswanden, een relatie benaderd door Poisson verdeling. Als zodanig worden de binaire resultaten (positieve of negatieve PCR) genoteerd en de frequentie van positieve druppels wordt gebruikt om onbekende monster concentraties berekenen direct via Poisson benadering, waardoor de noodzaak voor een standaardkromme zoals in qPCR.
Dit binaire aard van digitale PCR kwantificering biedt extra voordelen ten opzichte van qPCR 7. Omdat vertraagde versterking nog steeds een positieve PCR kan opleveren, dPCR kwantificering is robuuster tegen remming die amplificatie-efficiëntie vermindert. Evenzo is dPCR kwantificering niet beïnvloed door variabiliteit in Cq waarden volgens qPCR, leidt tot een hogere nauwkeurigheid van dPCR opzichte qPCR 8-10.
Bovendien, de partitionering proces zorgt voor een zeer kleine hoeveelheid doel-DNA aanwezig in elke druppel effectief minimaliseren substraatcompetitie (in amplification van verschillende DNA-targets) die gemeenschappelijk belemmeringen voor het bereiken van dubbelzijdig afdrukken (dwz een test meet gelijktijdig twee DNA-doelen) in qPCR zijn. Als zodanig, of run in duplex of simplex (dwz één doelstelling wordt gemeten in een enkele test) dPCR produceert bijna niet te onderscheiden kwantificering van beide doelen 7,11.
Het doel van de digitale PCR (EntHF183 dPCR) in dit artikel is om gelijktijdige directe kwantificering van de algemene fecal indicator Enterococcus spp verkrijgen. En de menselijke fecale geassocieerd HF183 marker met verbeterde nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en robuustheid tegen remming tov de qPCR tegenhangers. Deze test is met succes gebruikt voor het kwantificeren van fecale besmetting in milieu- zoet water, zeewater, en diverse fecaal materiaal 7, maar kan ook worden toegepast op andere vormen van water en afvalwater. Deze test houdt grote belofte voor het analyseren van sedimenten en bodems te wijten aan hets hoge tolerantie voor remming, maar verder onderzoek nodig is vanwege de complexiteit van de inhibitor mengt in dit soort monsters.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn een paar kritische stappen in het protocol. Ten eerste, het mengen van de proefmengsels kan moeilijk zijn omdat de master mix viskeuzer dan conventionele qPCR mastermengsels. Eenvoudige vortexen kan leiden tot onvoldoende menging, wat leidt tot niet-uniforme verdeling van DNA templates in de proefmengsels en vervolgens in de druppeltjes. Het mengen-by-pipetteertechniek beschreven in het protocol moet worden gevolgd om nauwkeurige dPCR kwantificering te verzekeren. Ten tweede is het belangrijk ervoor te zorgen dr…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20uL pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200uL pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E.faecalius genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalius and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
Referenzen
- Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).
- Layton, B. A., et al. Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study. Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).
- Cao, Y., et al. Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods. Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).
- Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples. J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).
- Huggett, J. F., et al. The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).
- Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment. Water Res. 70, 337-349 (2015).
- Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification. Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).
- Whale, A. S., et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR. PLoS One. 8 (5), e62583 (2013).
- Cao, Y., et al. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).
