对小鼠淋巴瘤模型监测肿瘤进展和治疗效果生物发光基于肿瘤定量方法

所有涉及小鼠过程符合欧盟的指导方针，法语条例动物实验（编号2001-464农业部法令，2001年5月），和国家研究所德拉桑特等德拉RECHERCHE MEDICALE（INSERM）委员会的指导方针动物研究，并分别由有关地方委员会批准（查尔斯·达尔文伦理委员会的动物实验，巴黎，法国;许可证号：P3 / 2009/004）。 1.细胞的制备生长小鼠B淋巴瘤细胞系A20.IIA-luc2在补充有10％胎牛血清，100μg/ ml的青霉素，100微克/ ml链霉素，10mM的丙酮酸钠，50μM2-巯基乙醇，和0.50的RPMI-1640 Glutamax的培养基毫克/ ml潮霉素B. 维持细胞培养物，在37℃，5％CO 2和改变介质每两至三天。收获5毫升用吸管一天细胞悬浮液更换培养基后。 旋转单元3005;克10分钟，悬浮细胞在3ml无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）。重复此步骤两次以洗涤细胞。 加载Malassez计数室之前混合15微升30微升台盼蓝标记细胞悬液。与式计算细胞浓度：浓度（细胞/ ml）=细胞在计数网格* 3 * 1000号。 旋转细胞一次，在300×g离心10分钟。用移液管除去上清液。用C在步骤1.4计算出的浓度），细胞的数目是N = C * 3。 计算无菌PBS 1×中的5×10 7个细胞/ ml与下式的浓度，以获得细胞悬液的必需体积：PBS容积（毫升）= N /（5×10 7）。暂停将细胞沉淀（来自步骤1.5）在无菌PBS 1X的前一句中计算出的体积）。细胞悬浮液A在SCL模型中使用（ 在体内注射体积为100微升：5×10 6细胞S）。 吸管10微升细胞悬浮液A和添加90微升无菌PBS在1.5ml管中，在每毫升5×10 6个细胞，得到100微升细胞悬浮液B辑。细胞悬浮液B是在PIOL模型中使用（ 在体内注射体积是2微升：1×10 4个细胞）。 2.荧光素在一个50毫升管稀1克D-萤光素钾盐粉末在30毫升无菌PBS 1X和摇动几秒钟，以溶解聚集体。 注：由于荧光素是光敏感，准备在黑暗的1.5毫升离心管500微升等分。 储存在-20℃的等分试样。 注：等分试样可存放数个月。 融化后，将等分试样不能在+ 4℃下储存超过1天。冻融循环是优选在4℃下贮存。 注入100微升D-萤光素钾盐溶液腹膜内为每个成像阿萨年。 注意：此溶液相当于每只小鼠3.3毫克的剂量为150毫克/公斤。 3.麻醉剂混和麻醉制备通过在无菌PBS中1×混合氯胺酮120 mg / kg和赛拉嗪6毫克/公斤的麻醉剂溶液。 注入60微升麻醉剂混腹腔与将25g针头每个成像试验。手术（与​​PIOL或SCL模型），注入80微升混合物，得到更深入的麻醉。将鼠标放回笼子。 当鼠标不动的出现，从笼中取出，并轻轻挤压手指之间的鼠标的腿。如果鼠标与逃避反射反应，等待几分钟。重复上述动作，直到鼠标没有反应，这证实了满意的麻醉。 把鼠标放在一个保温盘或下一个变暖的光。 应用眼膏，以避免麻醉的成像试验或SCL在手术过程中眼睛干涩。应用手术的PIOL模型后眼膏。 4.手术和细胞接种注：在保温盘或下一个变暖的光执行所有外科手术，在1型微生物安全柜在动物生物安全2级设施。在本节中使用的所有外科手术刀具使用前高压灭菌。 皮下淋巴瘤型号： 制备100微升在1-ml注射器与地下25针在步骤1.6中得到的细胞悬浮液。轻轻挤压上的手指之间的侧面的小鼠皮肤，在注射部位。插入针恰好进入皮肤褶皱。为确保皮下注射，不针放在深入到组织。 注入细胞进入皮褶。观察有无在皮肤下会出现一个小液体球，以确认注射正确执行。 PIOL模型： 注：此PROCE杜热要求2的运营商，这里称为操作者1和操作2。 结膜去除： 具有操作员1处解剖显微镜下鼠标。轻轻按压与眼睛的两侧的手指来清除它。保持这个姿势。 必须通过解剖显微镜操作2升书籍。握一把小单手钳的结膜;用另一只手，切只是钳子下面结膜用小一对外科剪刀。 具有操作员1释放步骤4.2.1.1按下鼠标的眼睛） 细胞注射： 准备一个10微升钝精密注射。通过它抽灭菌去离子水清洗。重复两次或三次，以确保有在注射器无气泡。然后准备2微升细胞悬浮液的注射。 具有操作员2轻轻按压与手指上Ë手眼的每一边将其清除。保持这个姿势。 有操作员1夹持眼用小钳子在一方面边缘，将其轻轻地向后伸展的组织。 必须通过解剖显微镜操作2升书籍。用另一只手，使得在同一个32克针鼠标的劣眼球的小孔。 具有操作员2放下针，拿起（用同一只手）精密注射器和针头插入步骤4.2.2.4所做的洞。 对用另一只手的注射器活塞操作1推。 有操作员2 V erify与在注射器中的细胞悬浮液已在眼球内被正确地喷射出的解剖显微镜（液体流很容易观察到的）。 具有操作员2 R emove的精密注射。 具有操作员1新闻稿的一个边缘进制眼睛笼罩在步骤4.2.2.3） 具有操作员2新闻稿眼睛的两侧步骤4.2.2.2按下） 立即应用眼膏。 注意：如果被正确执行的所有步骤，鼠标不应该在此过程中流血的。 5.生物发光成像 – 0天注：注入小鼠的所有产品必须在RT注射前。肿瘤细胞后，已经接种，并且在动物仍在麻醉，进行这些步骤的成像。 打开相机，打开采集软件。通过点击“初始化”按钮初始化相机，阶段，和透镜。初始化将需要10到15分钟，以完成。 注100微升的D-荧光素钾盐将25g针腹腔解决方案。不要静脉管理它。如果intravenou行政体系所需的任何原因，D-荧光素钠盐 ，必须使用而非D-萤光素钾盐 。 注：萤光素是在该浓度的过量反应物;因此，生物发光信号到达后3〜7分钟的高原，持续超过30分钟。 10分钟 D-荧光素注射后13，将标的鼠标在成像仪。鼠标放置在其自然的位置，其对相机后背 ，在平坦的位置成为可能。这一立场是自然的，容易复制。 勾选自动曝光功能，点击采集获取动物的背部 （后）的形象，与自动曝光功能。 注：自动曝光功能，通过从1秒曝光的图片计算它优化曝光时间。如果鼠标的生物发光信号是负的或非常低的，最佳曝光时间可能是自动设定为超过20分钟。在这种情况下，为8至10分钟的曝光时间可以是一个良好的折衷。曝光时间可以被手动设置，但图像不能包含饱和的像素 。 转动鼠标以暴露鼠标到相机的正面 。尽量扁平化鼠标和传播其前肢，使它们不会阻塞胸前。 采集动物的正视图像。验证自动曝光复选框被选中还是并在“采集”按钮，再次点击。 注：前图像会在背部图像之前被收购，反之亦然。正面和背面的图像的曝光时间可以根据鼠标的每一侧的相对强度是不同的。它正在使用的自动曝光功能时自动计算。量化只使用光子通量（ 每秒光子）和不依赖于曝光时间。 把鼠标放在变暖高原e或下一个变暖的光，直到它从麻醉中恢复，然后将其放回笼子里。 6.生物发光成像 – 0天之后打开相机，初始化相机，阶段，和透镜如在步骤5.1）。 麻醉小鼠的氯胺酮（120毫克/千克）/赛拉嗪（6毫克/公斤）混合物的60微升（见步骤3.1至3.5）腹膜内注射。 注：麻醉的这种方法允许成像每5天。执行日常成像，需要麻醉并适用于本麻醉剂使用生物发光成像，使用异氟醚的方法。 采集动物的正面和背面的图像，使用自动曝光功能，如在步骤5.5）和5.6）。处理鼠标按步骤5.7）。 7.生物​​发光定量与图像分析注：luminoscore方法基于图像analysi秒。一旦图像已经根据上述步骤被收购，量化可以在任何时间执行（采集后立即含），以在每个时间点一luminoscore到每只小鼠关联。 通过点击“查看”菜单上显示“工具选项板”，然后点击“工具选项板”如果尚未显示出来。点击工具面板中的“投资回报工具”选项卡。选择“轮廓”按钮，然后选择“免费抽奖”。 通过前视图下鼠标的边缘手动标记感兴趣区域（ROI）周围的鼠标的地区。与电脑鼠标右键单击关闭轮廓。 点击“查看”菜单，然后选择“ROI测量”上。确保“光辉（光子）”中的“测量类型”中选择了“ROI测量”窗口左下角的滚动菜单。如果不是，选择它。然后测量光子FLUX（PH / s）的记录在“总光通量[P / S]”框中的值。 注意：不要使用辉耀或者其他单位，是相对于投资回报率的表面积。 重复步骤7.2）和7.3）的后视图 。 总结从正面和背面视图得到的两个光子通量的值。结果是luminoscore。 比较的值使用适当的统计检验每个组（非参数双尾Mann-Whitney检验，例如）14。