Au-Interacción de SLP1 Polímeros y Monocapa de<em> Lysinibacillus sphaericus</em> JG-B53 - QCM-D, ICP-MS y AFM como Herramientas para Estudios Biomolécula metálicos

Debido al creciente uso del oro para diversas aplicaciones como la electrónica, catalizadores, biosensores, o instrumentos médicos, la demanda de este metal precioso ha crecido en los últimos pocos años ^6-9. Oro, así como muchos otros metales preciosos y pesados ​​se liberan en el medio ambiente a través de efluentes industriales en concentraciones diluidas, a través de las actividades mineras, y la eliminación de residuos ^7,8,10, aunque la mayor contaminación ambiental por metales pesados ​​o preciosos es un proceso en curso causado principalmente por las actividades tecnológicas. Esto conduce a una interferencia significativa de los ecosistemas naturales y potencialmente podría amenazar la salud humana ^9. Conocer estos resultados negativos promueve la búsqueda de nuevas técnicas para eliminar los metales de los ecosistemas y las mejoras en el reciclaje de metales contaminados por las aguas residuales industriales. Métodos físico-químicos bien establecidos como precipitación o intercambio de iones no son tan eficaces, especialmente en altoly diluye soluciones ^7,8,11. Biosorción, ya sea con la vida o la biomasa muerta, es una alternativa atractiva para el tratamiento de aguas residuales ^10,12. El uso de tales materiales biológicos puede reducir el consumo de productos químicos tóxicos. Muchos microorganismos se han descrito para acumular o inmovilizar metales. Por ejemplo, las células de Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 han demostrado capacidades de unión altos para los metales preciosos, por ejemplo, Pd (II), Pt (II), Au (III), y otros metales tóxicos como el Pb (II) o U (VI) ^4,13, las células de Bacillus megaterium para Cr (VI) ^14, las células de Saccharomyces cerevisiae para Pt (II) y Pd (II) ^15, y Chlorella vulgar para Au (III) y U (VI) ^{16 , 17.} La unión de los metales anteriores como Au (III), Pd (II) y Pt (II) también se ha informado de Desulfovibrio desulfuricans ¹⁸ y para L. sphaericus JG-B53 ^19,20. Sin embargo, no all microbios unen altas cantidades de metales y su aplicación como material de sorción es limitada ^12,21. Además, la capacidad de unión a metal depende de diferentes parámetros, por ejemplo, la composición celular, la bio-componente utilizado, o ambientales y las condiciones experimentales (pH, fuerza iónica, temperatura, etc.). El estudio de los fragmentos de pared celular aisladas ^22,23, como los lípidos de membrana, peptidoglicano, proteínas u otros componentes, ayuda a entender el metal procesos de células enteras construidas complejas ^8,21 vinculante.

Los componentes de la célula se centraron en en este estudio son las proteínas de la capa S. Proteínas de la capa S son partes de la envoltura celular externa de muchas bacterias y arqueas, y que constituyen aproximadamente el 15 – 20% de la masa total de proteínas de estos organismos. A medida que la primera interfaz para el medio ambiente, estos compuestos celulares influyen fuertemente en las propiedades de sorción ³ bacterianas. Proteínas de la capa S con pesos moleculares que van desde los cuarentaa cientos de kDa se producen dentro de la célula, pero se ensamblan exterior, donde son capaces de formar capas en las membranas de lípidos o componentes de la pared celular poliméricos. Una vez aislado, casi todos los S-capa proteínas tienen la propiedad intrínseca de auto-ensamblan espontáneamente en suspensión, en las interfaces, o en superficies planas que forman o estructuras similares a tubos ^3. El espesor de la monocapa de la proteína depende de la bacteria y se encuentra dentro de una gama de 5 – 25 nm ^24. En general, las estructuras de las proteínas S-capa formada pueden tener un oblicua (P1 o P2), cuadrada (p4), o hexagonal (p3 o p6) simetría con constantes de red de 2,5 a 35 nm ^3,24. La formación de celosía parece ser en muchos casos dependientes de cationes divalentes y principalmente en Ca ^{2+ 25,26, Raff, J. et al. S-capa de nanocompuestos basados ​​en aplicaciones industriales en a base de proteína Engineered Nanoestructuras. (eds Tijana Z. Grove y Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2}016 (presentado)). Sin embargo, la cascada de la reacción completa de plegado monómero, la interacción monómero-monómero, la formación de un enrejado, y el papel de diferentes metales, especialmente de cationes divalentes tales como Ca ^{2+ y} Mg ^2+, todavía no se entiende completamente.

La cepa grampositivos L. sphaericus JG-B53 (renombrado de Bacillus sphaericus después de nueva clasificación filogenética) ²⁷ se aisló de la minería del uranio pila de residuos "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Sajonia, Alemania) ^4,28,29. Su proteína S-capa funcional (SLP1) posee una red cuadrada, un peso molecular de 116 kDa ^30, y un espesor de 10 nm sobre ≈ células de las bacterias que viven ^31. En estudios anteriores, la formación in vitro de una capa de proteína cerrado y estable con un espesor de aproximadamente 10 nm se logró en menos de 10 min ^19. La cepa relacionada L. sphaericus JG-A12, también un aislamiento de la pila "Haberland", posee capacidades de unión de alta de metal y su proteína aislada S-capa ha mostrado buenos índices de absorción alta estabilidad química y mecánica y para los metales preciosos como el Au (III), Pt (II), y Pd (II) ^4,32,33. Esta unión de los metales preciosos es más o menos específica para algunos metales y depende de la disponibilidad de grupos funcionales en la proteína de superficie exterior e interior del polímero y en sus poros, la fuerza iónica, y el valor pH. Grupos funcionales relevantes para la interacción de metal por las proteínas son _COOH, NH2 -, OH-, PO ₄ -, _SO 4 – y SO. En principio, la capacidad de unión a metal abren un amplio espectro de aplicaciones, ^{Raff, J. et al. S-capa de nanocompuestos basados ​​en aplicaciones industriales en a base de proteína Engineered Nanoestructuras. (eds Tijana Z. Grove y Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentado)).} por ejemplo, como componentes biosorptive para la eliminación o la recuperaciónde metales tóxicos o valiosos disueltos, plantillas para la síntesis o deposición definido de nanopartículas estructuradas regularmente metálicos (NPS) para la catálisis y otros materiales de bioingeniería como capas bio-sensorial ^3,5,18,33. Arrays NP dispuestos regularmente como Au (0) -NPs podrían ser utilizados para las principales aplicaciones que van desde la electrónica molecular y biosensores, dispositivos de almacenamiento de densidad ultra alta, y catalizadores para la oxidación de ^CO-34-37. El desarrollo de este tipo de aplicaciones y el diseño inteligente de estos materiales requiere una comprensión más profunda de los mecanismos de unión de metales subyacentes.

Un requisito previo para el desarrollo de tales materiales de origen biológico es la implementación fiable de una capa de interfaz entre la biomolécula y la superficie técnica ^38,39. Por ejemplo, polielectrolitos ensamblan con la capa por capa (LBL) ^40,41 técnica se han utilizado como una capa de interfaz para la recristalización de las proteínas de la capa ^S-39 </sup>. Tal interfaz ofrece una forma relativamente fácil de realizar el recubrimiento de proteína de una manera reproducible y cuantitativa. Mediante la realización de diferentes experimentos con y sin modificación con promotores adhesivos, es posible hacer declaraciones con respecto a la cinética de revestimiento, la estabilidad de la capa, y la interacción de los metales con biomoléculas ^{19,42, Raff, J. et al. S-capa de nanocompuestos basados ​​en aplicaciones industriales en a base de proteína Engineered Nanoestructuras. (eds Tijana Z. Grove y Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentado)).} Sin embargo, el complejo mecanismo de la adsorción de proteínas y la interacción proteína-superficie no se entiende completamente. Especialmente información sobre la conformación, la orientación de patrones, y densidades de recubrimiento sigue desaparecido.

Cuarzo microbalanza de cristal con el monitoreo de disipación (QCM-D) técnica ha llamado la atención en los últimos años como una herramienta para el estudio de la adsorción de proteínas, la cinética de revestimiento, y la interacción proprocesos en la escala nanométrica ^19,43-45. Esta técnica permite la detección detallada de la adsorción de masas en tiempo real, y se puede utilizar como un indicador para el proceso de auto-montaje de proteínas y el acoplamiento de moléculas funcionales en redes de proteínas ^{19,20,42,46-48.} Además, las mediciones QCM-D abren la posibilidad de estudiar los procesos de interacción de metal con la capa proteínica en condiciones biológicas naturales. En un estudio reciente, la interacción de la proteína S-capa con metales seleccionados como Eu (III), Au (III), Pd (II) y Pt (II) se ha estudiado con QCM-D ^19,20. La capa de proteína adsorbida puede servir como un modelo simplificado de una pared celular de las bacterias gram-positivas. El estudio de este componente único puede contribuir a una mayor comprensión de la interacción metal. Sin embargo, únicamente los experimentos QCM-D no permiten declaraciones con respecto a las estructuras superficiales y las influencias de los metales a la proteína. Otras técnicas son necesarias para obtener dicha información. Uno posbilidad de imágenes bio-nanoestructuras y la obtención de información sobre las propiedades estructurales es la microscopía de fuerza atómica (AFM).

El objetivo del estudio presentado fue investigar la sorción de oro (Au (III) y Au (0) -NPs) a las proteínas de la capa S, en particular SLP1 de L. sphaericus JG-B53. Los experimentos se realizaron con las proteínas en suspensión en la escala de proceso por lotes en un intervalo de pH de 2,0 – 5,0 usando ICP-MS y con S-capas inmovilizadas utilizando QCM-D. Además, la influencia de la solución de sal de metal sobre la estabilidad de celosía se investigó con los estudios de AFM posteriores. La combinación de estas técnicas contribuye a una mejor comprensión de los procesos de interacción in vitro de metal en como una herramienta para aprender más acerca de los acontecimientos en las células bacterianas enteras respecto afinidades metálicos específicos vinculante. Este conocimiento no sólo es crucial para el desarrollo de materiales de filtración aplicables para la recuperación de metales para la protección ambiental y la conservación de la re⁴⁹ fuentes, sino también para el desarrollo de matrices de NPs metálicas altamente ordenadas para diversas aplicaciones técnicas.