Culturas de geração primária de fibroblastos de rato orelha e da cauda Tecidos
Summary
Nós descrevemos um procedimento experimental simples e rápida para a geração de fibroblastos primários dos ouvidos e caudas de camundongos. O processo não requer a formação especial animal e pode ser utilizado para a geração de culturas de fibroblastos de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias.
Abstract
As células primárias são derivadas directamente a partir de tecidos e pensa-se ser mais representativo do estado fisiológico das células in vivo do que as linhas de células estabelecidas. No entanto, as culturas de células primárias geralmente têm um tempo de vida finito e precisa de ser frequentemente restabelecida. Os fibroblastos são uma fonte facilmente acessível de células primárias. Aqui, discutimos um procedimento experimental simples e rápida para estabelecer culturas de fibroblastos primários de orelhas e rabos de ratos. O protocolo pode ser utilizado para estabelecer culturas de fibroblastos primários de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias. Quando o protocolo seguido é cuidadosamente, as contaminações não são susceptíveis de ocorrer, apesar da utilização de tecido não-estéril armazenada por tempo prolongado, em alguns casos. Os fibroblastos proliferam rapidamente em cultura e pode ser expandido para um número substancial antes de se submeter a senescência replicativa.
Introduction
As células primárias são derivadas a partir de tecido vivo e cultivadas sob condições in vitro. Geralmente assume-se que as células primárias mais se assemelham ao estado fisiológico e o fundo genético do tecido a partir do qual foram produzidos de linhas de células imortalizadas ou de tumor 1. Por essa razão, as células primárias representam um modelo útil para o estudo biológico perguntas 2,3. No entanto, ao contrário de linhas celulares estabelecidas que crescem indefinidamente, células primárias, eventualmente, submetidos a senescência em cultura e têm de ser frequentemente restabelecida.
Células primárias vulgarmente utilizados incluem fibroblastos, células epiteliais, células endoteliais, células T, células B, macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) e células dendríticas derivadas de medula óssea (BMDC). Os fibroblastos são muitas vezes utilizadas como modelo de cultura celular primária. Eles oferecem vantagens sobre outras células primárias. As culturas celulares são facilmente estabelecida, facilmente mantido e não necessitam de purificação de células antes da cultura. Eles têm proliferação inicial rápida e sem exigência de protocolos de médio ou de activação especializados. Os fibroblastos podem ser eficientemente transfectadas utilizando protocolos físicos 4,5 biológicas, químicas, e. Existe uma possibilidade de armazenar as orelhas para até 10 dias à TA antes de estabelecer culturas de células. Culturas de fibroblastos são propícias para visualização de processos citoplasmáticos e adequado para reprogramação em tronco pluripotentes induzidas (iPS) células 6.
Os fibroblastos são importantes células do tecido conjuntivo que segregam proteínas de colagénio e na matriz extracelular 7. Eles fornecem o quadro estrutural em muitos tecidos e 8 desempenham um papel essencial na cicatrização de feridas e reparação de tecidos 9,10.
Aqui, descrevemos um (<4 h) protocolo simples e rápida para estabelecer culturas de fibroblastos de orelhas e rabos de ratos 11. O protocolo exige rato mínimaexperiência para colher os tecidos (em contraste com outros protocolos 12,13) e pode ser utilizado para estabelecer culturas de orelhas armazenados em meio à temperatura ambiente durante até 10 dias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós fornecemos um procedimento experimental simples, barato e rápido para estabelecer culturas de fibroblastos primários de orelhas e rabos de ratos. A extracção deve resultar em fibroblastos aderentes dividem rapidamente e dentro de 3 dias após o isolamento do tecido. Uma importante limitação de pilhas é senescência, uma parada do crescimento permanente 15. Usando o protocolo, culturas de fibroblastos podem ser passadas durante 5 a 6 vezes antes de se tornar fibroblastos senescentes, indicado …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE – Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.
Materials
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
Referenzen
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. J Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
- Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).
- Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).
- Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
- Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
- Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).
- Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
- Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).
