Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea
Summary
Wir präsentieren eine Methode, um die Erwachsenen Corti-Organ als drei intakte Cochlea-Windungen (Spitze, mittlere und Base) zu isolieren. Wir haben auch ein Verfahren zur Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern nachzuweisen. Zusammen ermöglichen diese Verfahren die Untersuchung der Haarzellen, Stützzellen und anderen Zelltypen in der Cochlea vorhanden.
Abstract
The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.
Introduction
Die spiralförmige Cochlea des Innenohres, innerhalb des Schläfenbeins enthalten, beherbergt das Corti-Organ, das auditive Sinnes Endorgan bei Säugetieren. Die Cochlea ist tonotopically organisiert und gewöhnlich in apikal, mittig geteilt, und basalen Windungen auf verschiedene Frequenzbereiche mit hochfrequenten Schallerkennung in der Basis und Niederfrequenzerkennung entsprechend der Spitze 1. Haarzellen, die mechanosensorischen Zellen des Corti-Organ, führen Sie die Länge der Cochlea, die etwa 6 mm lang bei Mäusen 2,3 ist. Diese Zellen wandeln die mechanische Energie der Schallwellen, die durch die mit Flüssigkeit gefüllte häutige Labyrinth übertragen werden, in neuronale Signale, die von zentralen auditorischen Strukturen verarbeitet werden. Die hier beschriebene Technik stellt ein Verfahren zur Herstellung von ganzen Bergen von Corti-Organ nach der Verkalkung der Cochlea abgeschlossen ist (für die Proben von einer Woche im Alter bis zum Erwachsenenalter). Wir präsentieren auch ein Verfahren zur immunostaining der ganzen montiert Cochlea-Gewebe. Cochlear Gesamtpräparate sind entscheidend für die Visualisierung der Haarzellen und Stützzellen umgibt in ihrer natürlichen räumlichen Anordnungen und ermöglichen eine Analyse in drei Dimensionen unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie.
Drs. Hans Engström und Harlow Ades beschrieb ursprünglich eine ganze montieren Cochlea-Dissektion Verfahren im Jahr 1966. Sie detailliert eine Technik, um schnell zu fixieren und zu sezieren verkalkten cochleae in Flüssigkeit eingetaucht ist aus einer Vielzahl von Säugetieren, die Erhaltung intakter kurzen Segmenten des Corti-Organ für die mikroskopische Analyse 4. Die Präparation eines nicht fixierten, verkalkten Cochlea der Ratte hat sich auch in einem Lehr-Video 5 dargestellt. Drs. Barbara Bohne und Gary Harding an der Washington University, machte einige wichtige Veränderungen an dieser Methode. In ihrer Version der Cochlea ganze Berg-Methode, war das Schläfenbein entkalkt, in Kunststoff eingebettet und fünf Halbdrehungen oder zehn Viertel-Drehungen waren dissected 6,7. Dr. Charles Liberman und Kollegen an Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Eye and Ear Infirmary, modifiziert diese Technik so, daß Kunststoff-Einbettung nicht erforderlich 8. Weitere Modifikation der Technik traten bei Dr. Jian Zuo Labor in St. Jude-Kinderkrankenhaus 9-12, die die hier präsentierten Dissektion Verfahren informiert. Wir verwenden eine andere Strategie, um Zugriff auf das Corti-Organ als Bohne und Liberman, die Isolierung der kompletten apikalen, mittleren und basalen Umdrehungen ermöglicht zu gewinnen. Damit die sezierten Gewebe grßer und weniger wahrscheinlich, dass während der Dissektion oder Immunprozesse verloren gehen oder beschädigt werden. Darüber hinaus erleichtert die aktuelle Methode Messung des Abstandes von der apikalen Spitze oder basal Haken um einen Frequenzbereich zu ermitteln.
Obwohl viele Labors durchführen Immunfärbung von Cochlea-Gewebe, ist unklar, wo diese Methode entstand. Als Ergebnis gibt es verschiedene Rezepte zum Blockieren buffeRS und Antikörperinkubation Puffer, die die Leistung der einzelnen primären Antikörper beeinträchtigen kann. Hier stellen wir ein Verfahren zur Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die für die am häufigsten verwendeten Antikörper im auditorischen Bereich ist.
Die komplexe Form der Cochlea, zarte Struktur des Corti-Organ, und knöchernen Umhüllung eine Herausforderung für die histologische und biochemische Analyse. Eine Vielzahl von Techniken sind derzeit in der mündlichen Verhandlung Feld verwendet, um diese schwierige Features zu überwinden und die Zellen zu visualisieren im Corti-Organ, jede Technik mit eigenen Vor- und Nachteile. Die hier vorgestellte Protokoll erlaubt ganze Berg Dissektion der erwachsenen Maus Cochlea und mit leichten Modifikation kann potentiell verwendet werden, um die kritischen Strukturen im cochleae aus einer Vielzahl von anderen auf dem Gebiet verwendet werden Modellorganismen untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere wichtige Schritte für eine erfolgreiche ganze Berg Präparation und Immunfärbung. Jedoch, bevor Sie eine dieser Methoden durchgeführt werden, ist die richtige Fixierung der Cochlea Gewebe benötigt. Wir empfehlen die Verwendung von Methanol-freien, hochreine, EM Grade PFA. PFA von Pulver kann Spuren von Methanol und einem instabilen pH-Wert, die Qualität der Immunfluoreszenz abnimmt. Andere Gruppen haben gezeigt, dass ähnliche Sektionen sind mit Hilfe Fixiermittel die Formaldehyd 14-16</s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).
Materials
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC –wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48 well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8 well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
Referenzen
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