توليد كريسبر / Cas9 ساطة Monoallelic الحذف لدراسة وظيفة محسن في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس
Summary
Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus129 x Mus castaneus).
Abstract
Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer’s role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus129 x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.
Introduction
العناصر التنظيمية النسخي حاسمة لضبط المكانية والزمانية في التعبير الجيني خلال تنمية (1) وتعديل هذه العناصر يمكن أن يؤدي إلى المرض بسبب التعبير الجيني الشاذة 2. العديد من المناطق الأمراض المرتبطة حددها الجينوم الدراسات جمعية واسعة هي في مناطق غير الترميز ولها ميزات معززات النسخي 3-4. تحديد القدرة ومضاهاتها مع الجينات التي تنظم معقدة لأنها غالبا ما تقع عدة kilobases بعيدا عن الجينات التي تنظم ويمكن تفعيلها بطريقة الأنسجة محددة 5-6. وتستند توقعات محسن عادة على علامات هيستون تعديل، مجمعات للوسيط cohesin وملزمة من نوع معين الخلية عوامل النسخ 7-10. وغالبا ما يتم التحقق من القدرة على التنبؤ من خلال فحص ناقلات القائم فيها محسن ينشط التعبير عن الجينات مراسل 11-12. وتوفر هذه البيانات الخامسمعلومات aluable حول إمكانية التنظيمية للتسلسل محسن المفترضة ولكن لا تكشف عن وظيفتها في سياق الجيني الذاتية أو التعرف على الجينات التي تنظم. يخدم تحرير الجينوم كأداة قوية لدراسة وظيفة العناصر التنظيمية النسخي في سياقها الذاتية عن طريق تحليل الخسارة من وظيفة.
التطورات الحديثة في تحرير الجينوم، وهما / Cas9 تحرير النظام الجينوم كريسبر، تسهيل التحقيق في وظيفة الجينوم. النظام / Cas9 كريسبر سهلة الاستخدام وقابلة للتكيف لكثير من النظم البيولوجية. ويستهدف هذا البروتين Cas9 إلى موقع معين في الجينوم عن طريق الحمض النووي الريبي دليل (gRNA) 13. مجمع SpCas9 / gRNA بفحص جينوم للتسلسل الجيني هدفه الذي يجب أن يكون 5 'إلى protospacer عزر المجاور (PAM) تسلسل، NGG 14-15. الاقتران قاعدة gRNA إلى هدفه، 20 النوكليوتيدات (الإقليم الشمالي) تسلسل مكملة لgRNA، ينشط النشاط نوكلياز SpCas9 مما أدى إلى عزل مزدوكسر ه حبلا (DSB) 3 بي بي المنبع من سلسلة حزب الأصالة والمعاصرة. ويتحقق خصوصية من خلال قاعدة الاقتران الكامل في المنطقة المصنفة gRNA، 6-12 الإقليم الشمالي المحاذي لحزب الأصالة والمعاصرة. على العكس، عدم التطابق 5 'من البذور وعادة ما يتم التغاضي 16-17. جهاز تسوية المنازعات قدم يمكن إصلاحه إما بنهاية غير المتجانسة الانضمام (NHEJ) إصلاح الحمض النووي أو التماثل الموجه إصلاح (HDR) mechanisms.NHEJ إصلاح الحمض النووي غالبا ما يخلق الإدراج / حذف (indels) من عدد قليل من الغليان في الموقع المستهدف التي يمكن أن تعطل في إطار مفتوح للقراءة (ORF) من الجين. لتوليد الحذف أكبر في الجينوم اثنين gRNAs، الذي تطويق المنطقة من اهتمام، ويمكن استخدامها 18-19. هذا النهج هو مفيدة بشكل خاص لدراسة معززات النسخي تتجمع في مناطق سيطرة موضع أو القدرة الفائقة التي هي أكبر من القدرة التقليدية 9،18،20-22.
الحذف Monoallelic هي نموذجا قيما لدراسة -regulation رابطة الدول المستقلة من النسخ. تشانغ لاحظه في مستوى النص بعد حذف monoallelic من محسن يرتبط إلى دور تلك محسن في تنظيم الجينات دون آثار الخلط التي يمكن أن تحدث عندما يتأثر النسخ من كل من الأليلات المحتمل أن تؤثر على اللياقة البدنية الخلوية. تقييم خفض التعبير من الصعب ولكن من دون القدرة على التمييز بين حذفها من نوع أليل البرية. وعلاوة على ذلك، التنميط الجيني الحذف في كل أليل دون القدرة على التمييز بين الاليلين يشكل تحديا، خاصة بالنسبة للالحذف كبيرة من> 10 كيلو بايت إلى 1 ميغابايت 23 التي من الصعب تضخيم كامل المنطقة نوع البرية من قبل PCR. استخدام الخلايا F1 ES الناتجة عن عبور المصحف العضلة 129 مع المصحف castaneus يسمح الاليلين لتكون متباينة من جانب أليل محددة PCR 18،24. الجينوم الهجين في هذه الخلايا يسهل أليل معين فحص الحذف وتحليل التعبير. في المتوسط هناك SNP كل 125 سنة مضت بين هذه الجينومات اثنين، وتوفير المرونة في التصميم التمهيدي للتعبير والتنميط الجيني يحلل. وجود واحد SNP يمكن أن تؤثر على درجة حرارة التمهيدي ذوبان (T م)، وتستهدف التحديد في الوقت الحقيقي الكمي التضخيم PCR (QPCR) مما يسمح للتمييز من اثنين من الأليلات 25. وعلاوة على ذلك عدم تطابق في نهاية 3 'من التمهيدي يؤثر بشكل كبير على قدرة البلمرة DNA لتمتد من التمهيدي منع التضخيم من الهدف الأليل غير المرغوب فيه (26). هو موضح في البروتوكول التالي هو استخدام الخلايا F1 ES لأليل معين الحذف محسن أكبر من 1 كيلو بايت وتحليل التعبير لاحق باستخدام / Cas9 تحرير النظام الجينوم كريسبر (الشكل 1).
الشكل 1. محسن الحذف باستخدام كريسبر / Cas9 لدراسة رابطة الدول المستقلة -regوتستخدم ulation التعبير الجيني. (أ) الخلايا F1 ES الناتجة عن خليط بين المصحف العضلة 129 و المصحف castaneus للسماح للأليل حذف معين. (ب) اثنين من الرنا دليل (gRNA) وتستخدم للحث على الحذف واسع بوساطة Cas9 للمنطقة محسن. وتستخدم (C) مجموعات التمهيدي لتحديد أحادية كبيرة والحذف ثنائية أليلية. الاشعال البرتقال هي الاشعال الداخل، الاشعال الأرجواني هي الاشعال الخارجية والاشعال الخضراء والاشعال المرافقة gRNA. ويتم رصد (D) التغيرات في التعبير الجيني باستخدام-أليل معين QPCR. RFU يدل على وحدات مضان النسبية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم كريسبر / Cas9 تكنولوجيا التحرير الجينوم بوساطة طريقة واضحة وسريعة وغير مكلفة لتعديل الجينوم. طريقة مفصلة هنا لتوليد وتحليل حذف محسن monoallelic لتوصيف وظيفي محسن يستفيد من تعدد الأشكال في الخلايا F1 الماوس. من مزايا هذا النوع من النهج هي: 1) الحذف محسن monoallelic لا تنتج آثار ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank all the members of the Mitchell lab for helpful discussions. This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research, the Canada Foundation for Innovation and the Ontario Ministry of Research and Innovation (operating and infrastructure grants held by JAM).
Materials
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | high fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid |
| pCas9_GFP | Addgene | 44719 | Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid |
| AflII | NEB | R0520S | |
| EcoRI | NEB | R3101S | |
| Neon Transfection System 100 µL Kit | Life Technologies | MPK10096 | Microporator transfection technology |
| prepGEM | ZyGEM | PT10500 | genomic DNA extraction reagent |
| Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| High-Speed Plasmid Mini Kit | Geneaid | PD300 | |
| Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free | Geneaid | PME25 | |
| SYBR select mix for CFX | Life Technologies | 4472942 | qPCR reagent |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 170-8891 | Reverse transcription reagent |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Life Technologies | 25200072 | |
| PBS without Ca/Mg2+ | Sigma | D8537 | |
| 0.5M EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175095 | |
| 1M HEPES | Life Technologies | 13630080 | |
| BSA fraction V (7.5%) | Life Technologies | 15260037 | |
| Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258012 | |
| FBS | ES cell qualified | FBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050 | |
| DMEM | Life Technologies | 11960069 | |
| Pencillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| Non-essential aminoacid | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924 | |
| Sealing tape | Sarstedt | 95.1994 | |
| CoolCell LX | Biocision | BCS-405 | alcohol-free cell freezing container |
| CHIR99021 | Biovision | 1748-5 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| PD0325901 | Invivogen | inh-pd32 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| LIF | Chemicon | ESG1107 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
Referenzen
- Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development. 132 (4), 797-803 (2005).
- Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. Long-range gene control and genetic disease. Adv Genet. 61, 339-388 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461 (7261), 199-205 (2009).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome. Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features. BMC Genomics. 13 (1), 152 (2012).
- Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
- Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
- Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
- Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).
- Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease. Nucleic Acids Res. 41 (20), e187 (2013).
- Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human ‘beta-like globin’ genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).
- Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
- Li, Y., et al. CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 9 (12), e114485 (2014).
- Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).
- Mlynarczyk-Evans, S., et al. X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation. PLoS Biol. 4 (6), e159 (2006).
- Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
- Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).
- Keane, T. M., et al. Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation. Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).
- Yalcin, B., et al. Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome. Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels. Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).
- Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension. J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
