Beurteilung der Maternal Vascular Remodeling während der Schwangerschaft in der Gebärmutter Maus
Summary
This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.
Abstract
The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.
Introduction
Der Austausch von Nährstoffen, Gasen und Abfallprodukten bei eutherian Schwangerschaft wird durch die Plazenta vermittelt. In der weiblichen Genitaltrakt, die Gebärmutterarterien sind die Hauptleitungen von Blut in die Gebärmutter. Nach der Implantation dieser Zweig in Spezialschiffe genannt Spiralarterien, die durch die Dezidua basalis Richtung fetoplazentaren Einheitsspule. Durchmesser und Elastizität dieser Spiralarterien, die durch Leukozyten umgeben sind, insbesondere Gebärmutter natürliche Killerzellen (unk) -Zellen, diktieren Volumen und die Geschwindigkeit des Blutes zur Verfügung Plazenta 1,2. Korrekte hämodynamischen Veränderungen infolge der Umgestaltung der Spiralarterien sind entscheidend für Erfolg der Schwangerschaft.
Während die zugrunde liegenden Mechanismen unterscheiden sich im Detail zwischen humanen und murinen Schwangerschaft, ist das endgültige Ergebnis der Umbauprozess in beiden Spezies erweitert, hoher Leitfähigkeit Gefäßsystem, das seinen glatten Muskulatur verliert. Bei Mäusen UNK-Zellen abgeleiteten Interferon (IFN-) γ ist notwendig, um diese Änderungen bei etwa der Mitte der Schwangerschaft 3-5 induzieren. Mäuse, die entweder NK-Zellen oder Komponenten der IFN-γ-Signalweg fehlt nicht, um diese Änderungen zu unterziehen, und dies wird mit reduzierter fetale Wachstum 6,7 zugeordnet, was die Wichtigkeit einer ausreichenden Blutversorgung des fetoplazentaren Einheit. Während der frühen Schwangerschaft, die interstitielle und endovaskuläre Invasion extravillösen Trophoblasten und ihre Wechselwirkung mit unk Zellen sind wichtig für die Induktion von Gefäßveränderungen und die Förderung der fetale Wachstum 8-10. unk Zellen können menschliche Trophoblasten-Invasion durch Chemokine 11 und Cytokine, wie Granulozyten-Makrophagen dirigieren – Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) 12. Shallow Trophoblastinvasion mit reduziertem arteriellen Umbau und Schwangerschaftskomplikationen wie Präeklampsie 9 verbunden.
Dieses Protokoll wird von der Pionierarbeit von Anne Croy, der die wichtigsten beschrieben auf der BasisRolle des Immunsystems und insbesondere NK-abgeleitete IFN-γ für eine erfolgreiche vaskuläre Remodelling durch Immunhistochemie und elegant Transferexperimente 5,13. Hier beschreiben wir eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, um den Umbau Status der Spiralarterien zu bewerten. Obwohl unser Labor routinemäßig beurteilt dies auf der Mitte der Schwangerschaft (Schwangerschafts Tag (gd) 9,5) 14, zwischen gd8.5 und 12,5 15 nimmt der Umbauprozess statt. Das Aufkommen von automatisierten Diascanner hat stark die Beurteilung der Gefäßlumen und Bereiche von Abschnitten erleichtert, und wir fanden, dass dies ein reproduzierbarer Ansatz als Messgefäßdurchmesser sein. Die Zugabe von immunhistochemischen Nachweis von SMA ermöglicht eine einfache Überprüfung der aus dem stereo Beurteilung erhaltenen Ergebnisse. Wie bei allen stereo Techniken, ist es empfehlenswert, die Beurteilung als blind Experiment von mindestens zwei Prüfern durchzuführen. Zu diesem Zweck kann eine Randomisierung Schritt eingeführt wird, wenn seriell schneidenting die Proben so, dass die Ermittler die Beurteilung der Objektträger nicht wissen, aus dem Versuchsgruppe die Proben kommen.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein zuverlässiges Werkzeug, um sorgfältig zu prüfen, die Umgestaltung der Spiralarterien bei Mäusen mit definierten mütterlichen und väterlichen Genotypen, im Zusammenhang mit der Mausmodelle für Schwangerschaftskomplikationen zu schaffen. Die Ergebnisse unterstreichen die Abhängigkeit von Unk Zellen dieser Prozess, der für die normale fetale Wachstum ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll ist so ausgelegt, ein reproduzierbares Verfahren, mit dem die Gefäßveränderungen, die für eine erfolgreiche Schwangerschaft erforderlich bewerten. Entscheidend für den Erfolg dieser Auswertung ist die Qualität der Gewebeschnitten. Sowohl die genaue Bestimmung der Schwangerschaftsalter der Implantationsstellen sowie zuverlässig Ligieren der Gebärmutterarterien sind entscheidende Schritte. Veränderungen in Parametern wie Zeitpunkt der Fixierung, Gewebeverarbeitung Protokoll usw. kann ebenfalls Einfluss auf das Ergebnis. Für eine unvoreingenommene stereoBewertung, ist es wichtig, die gleiche Anzahl von Schiffen in jedem Implantationsstelle zu messen. Es wird empfohlen, 5 Schiffe pro Implantationsstelle und jeder Implantationsstelle in dreifacher Ausführung zu messen. Der Mittelwert dieser 15 Messungen repräsentiert die mittlere Größe der 5 größten Gefäße.
Zusätzlich zu den Daten aus alymphoid Rag2 – / – IL2RG – / – hier gezeigten Mäuse, fanden wir dieses protOcol für eine Anzahl von Modellen von unzureichender mütterlichen Immunfunktion, einschließlich einer von NK-Zellen inhibierten 14. Defekte im arteriellen Umbau wurden auch in Modellen von beeinträchtigt Trophoblastinvasion 18 gezeigt und die hier beschriebenen Techniken können hilfreich sein, die Gefäßsystem in diesen Fällen zu beurteilen. Wir optimiert und validiert dieses Protokoll für die Untersuchung der Dezidua-vaskulären Remodelling in der Mitte der Schwangerschaft bei Mäusen, aber es ist auch denkbar, dieses Protokoll anzupassen in anderen Modellsystemen (zB Ratten) oder auch in andere Organe zu arbeiten. Während wir feststellen, dass die NK-abhängige Remodeling kann kräftig an gd9.5 beurteilt werden kann, kann es auch für andere Zeitpunkte wie gd12.5, wenn die mütterliche Vaskulatur ist komplett neu geändert werden. Zu diesem Zeitpunkt ist die endovaskuläre Trophoblastinvasion tiefere 16 und dieser Zeitpunkt besser geeignet für die Untersuchung der Rolle von Trophoblasten für vaskuläre Veränderungen. Wenn zusätzliche quantitative Ablesungen gewünscht werden,Ermittler können auch die Anzahl der Abschnitte für SMA befleckt zu erhöhen und zu bewerten den Anteil der teilweise umgebaut Gefäße innerhalb jeder Implantationsstelle.
Eine Einschränkung dieses Protokolls ist der beschreibende Charakter histologische Untersuchungen. Funktionelle Assays sind jedoch erst langsam verfügbar (zB Doppler-Ultraschall-19). Diese Techniken erfordern technisches Know-how und viel höhere Ausgaben für den Erwerb und die Aufrechterhaltung Ausrüstung, haben aber den Vorteil, dass eine Längs in vivo Anzeige für den Effekt der Änderungen, die histologisch beobachtet werden können. Ein möglicher Nachteil aller stereo Untersuchungen ist die Subjektivität der Ermittler. Zu diesem Zweck wird mit Hilfe von zwei unabhängigen Prüfern, die unabhängig voneinander alle Proben zu analysieren kann helfen, dieses Problem zu vermeiden. Während das Protokoll hier skizzierten gibt Einblick in, wie viel Blut das fetomaternalen Schnittstelle zu erreichen, kann es vorteilhaft sein, es mit dem kompl kombinierenementary Ansatz zur Bewertung der Gesamtblutmenge zu einem bestimmten Zeitpunkt in dem Gefäßsystem durch plastische wirft 16.
Die Stärke dieses Protokolls ist, dass sie zwei unabhängigen Ansätzen. Gefäßwechsel wird zunächst quantitativ durch Stereologie untersucht und das Ergebnis wird dann qualitativ mittels Immunhistochemie validiert. Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse können weiter verstärkt werden durch Randomisierung der Proben. Die für dieses Protokoll hergestellten Proben können leicht verwendet werden, um auch untersuchen, andere Parameter der Schwangerschaft wie Dezidualisierung, Entwicklung des mesometrial lymphatischen Aggregat der Schwangerschaft (mlap) oder Immundetektion von Zellen von Interesse, konsequent zu bewerten, eine Schwangerschaft Phänotyp bei midgestation werden.
Arterielle Remodeling ist ein entscheidender Schritt für die unkomplizierte Schwangerschaften bei Frauen und Misserfolg dieser Veränderungen untermauert die großen geburtshilflichen Syndromen (GOS), nämlich eine Präeklampsie, fetale Wachstumsrestriktion undTotgeburt. Wir stellen Ihnen hier Techniken, um sorgfältig zu prüfen, eine Schwangerschaft Phänotyp in Maus-Modellen, die einige Merkmale der Pathophysiologie der GOS imitieren.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.
Materials
| C57BL/6 mice (8-12 weeks old) | Charles River | ||
| Dental floss | |||
| Polystyrene | Used for holding tissue in place | ||
| Straight dissection scissors | EMS | 72940 | |
| 25G needles | BD | 300600 | Used for holding tissue in place |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P3813-10PAK | |
| Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
| Paraffin | Sigma | 327204-1KG | |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
| Automated tissue processor | Sakura | 6032 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Slide rack | Sigma | Z710989 | |
| Coplin jar | Sigma | S5891 | |
| Purified water | |||
| Hematoxylin solution, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
| Eosin Y solution | Sigma | HT110116-500ML | |
| Fume hood | |||
| Xylene-based mounting media | VWR | 361254D | |
| Slide scanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
| Slide scanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 32320 | Make 10 mM solution and adjust pH to 6 |
| Pressure cooker | Used for antigen retrieval | ||
| Heating plate | Used for antigen retrieval | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
| Tris buffered saline | Sigma | T6664-10PAK | |
| Mouse on mouse kit | Vector | BMK-2202 | Significantly reduces background |
| Mouse anti-human smooth muscle actin | DAKO | M0851 | Cross-reacts with mouse |
| IgG2a isotype control | DAKO | X0943 | |
| Humidified chamber | Sigma | H6644 | |
| 3,3’-Diaminobenzidine solution | Sigma | D4293-5SET | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |
Referenzen
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