L'utilisation de la cytométrie de flux pour évaluer l'état de la chromatine dans les cellules T

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole de l'animal a été approuvé par le (numéro de permis: de A3242-01) Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Furman. Tous les matériaux et l'équipement utilisés dans ce protocole peuvent être trouvés dans la table des matières et équipements, tandis que les tampons utilisés peuvent être trouvés dans la table des tampons et solutions. 1. Single suspension cellulaire des lymphocytes de rates de souris Sacrifiez souris via CO 2 asphyxie. Confirmez l'euthanasie par dislocation cervicale. Remarque: Utilisez les rates de deux vieux 6-8 semaines souris isogénique (par exemple, C57B / 6) du même sexe. En règle générale, deux rates sont traitées. Vaporiser les animaux abondamment avec une solution d'éthanol à 70% et orienter de telle sorte que la tête est tournée vers la gauche. En utilisant des pinces, soulever la peau de l'animal vers le haut et loin de til corps. Avec des ciseaux, couper une petite encoche dans la peau près de l'abdomen de l'animal. Avec les doigts, tirez de chaque côté de l'encoche pour exposer le péritoine du cou au début des pattes postérieures. La rate doit être visible directement sous le péritoine. En utilisant des pinces, soulever le péritoine et faire une petite incision pour exposer la rate. Retirer la rate avec une pince et utiliser des ciseaux pour taquiner l'écart toute tissu adipeux et conjonctif. Placer la rate dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de PBS supplémenté avec 2% de sérum bovin fœtal (ci-après dénommé PBS + 2%). Garder le tube sur la glace jusqu'à ce que prêt à commencer la suspension de cellule unique. Remarque: la récupération typique est entre 60 à 90.000.000 cellules par la rate, et typiquement, 2 millions de cellules sont nécessaires par échantillon. Effectuer toutes les étapes suivantes dans une hotte de culture de tissu. Décanter les rates dans une boîte de 100 mm de culture de tissu stérile. Obtenir deux lames de microscope givrées et maintenez til glisse de sorte que les deux surfaces rugueuses font face vers l'intérieur dépoli vers l'autre. Mouiller les lames dans la solution de PBS + 2% versé dans la boîte de Pétri. Maintenez la rate entre les surfaces dépolies des diapositives, avec les bords encore submergées, et broyer la rate doucement en déplaçant les glissières avant et en arrière une contre l'autre (figure 1A). Les cellules vont tomber dans la boîte de Pétri. Continuer de broyage jusqu'à ce que toutes les cellules ont été libérés et les restes de la rate apparaissent en blanc (figure 1B). Dresser la suspension cellulaire dans une pipette et filtrer lentement à travers un filtre de 70 um dans un nouveau 50 ml tube conique stérile. Notez que les petits morceaux de pulpe rouge seront présents sur le filtre (figure 2A). Si le filtre se lève doucement le soulever légèrement pour permettre au fluide de drain à travers et placez le filtre dans le tube conique de 50 ml et continuer, répétant ce processus si nécessaire. Si le traitement de plus de 5 SPLEens, il peut être nécessaire de diviser en deux lots et utiliser un nouveau filtre pour chaque. Utilisation de la partie de butée d'une seringue de 3 ml appuyez doucement sur ​​la pulpe rouge contenant les cellules restantes à travers le tamis (figure 2B). Assurez-vous d'appuyer sur les deux bas et les côtés filtre pour veiller à ce que toute la pulpe rouge a traversé le filtre (figure 2C). Ajouter 10 mlof PBS + 2% à la boîte de culture de tissu et l'utiliser pour laver les lames, seringue bouchon, et le plat pour récupérer toutes les cellules restantes. Passez-la dans le même 70 um tamis cellulaire dans le tube de 50 ml conique. Répétez cette étape si nécessaire. Centrifuger la suspension cellulaire filtré à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter délicatement et jeter le surnageant, attention à ne pas perturber le culot. Une quantité de trace de PBS + 2% sera laissé dans le tube. Boucher le tube et feuilleter le culot jusqu'à ce que le culot est remis en suspension complètement. Lyse des globules rouges par annonceDing 2 mL de ACK tampon de lyse (0,15 M NH 4 Cl, 1 mM KHCO3, EDTA 0,1 mM, pH 7,2, conserver à 4 ° C) par rate au tube conique et faire pivoter et inverser le tube pour assurer que toutes les cellules entrer en contact avec le tampon ACK. Agitez doucement le tube pendant 1 min à température ambiante. Amener le volume de la suspension de cellules à 50 ml par addition de PBS + 2% le tube pour neutraliser le tampon d'accusé de réception. Inverser le tube 10 fois et centrifuger pendant 5 min à 300 g à 4 ° C. Après la centrifugation est terminée, la pastille doit être blanc (figure 3). Décanter délicatement et jeter le surnageant, attention à ne pas perturber le culot. Laissez une trace de PBS + 2% dans le tube, fermer le tube, et feuilleter le culot de remettre en suspension. Ajouter 10 ml de milieu de cellules T [10% de FBS, 10 mM de HEPES (pH 7,0), 2 mM GlutaMAX, du pyruvate 1 mM de sodium, 1X acides aminés non essentiels, 1 x pénicilline / streptomycine et 50 mM β-mercaptoéthanol], et en outre remettre le culot en douceurpipetage de haut en bas. Puis filtrer la suspension à travers un filtre de 70 um dans un nouveau 50 ml tube conique. Utilisez un autre 5-10 ml de milieu de cellules T pour rincer le tube original et passer ce à travers le filtre de 70 um dans le tube contenant le reste des cellules filtrées. Si le traitement de plus de deux rates, le volume de milieu de cellules T peut être augmenté pour maximiser la récupération. Gardez cellules sur la glace jusqu'à ce que prêt à être colorés. Les cellules doivent être comptés et la viabilité accessibles. Pour compter les cellules, mélanger 3 ml de cellules avec 24 ml de PBS + 2% et 3 ml de 0,4% de bleu trypan. Charge 10 ml de cette entrée dans chaque chambre d'un hémocytomètre Neubauer amélioré. Viabilité, tel qu'évalué par l'exclusion du bleu trypan, est généralement comprise entre 85-95%. 2. Viabilité et coloration de la surface Pellet cellules par centrifugation pendant 10 min à 300 g à 4 ° C. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de lymphocytes T à une concentration de 1 x 10 7 cellules / ml. TransfEr 2 millions de cellules (100 ml) dans un puits d'une plaque à 96 puits de culture de tissu à fond en U. Centrifuger la plaque de 96 puits pendant 10 min à 300 g à 4 ° C. Retirer le surnageant de chaque puits en feuilletant liquide dans la plaque et dans l'évier (le culot cellulaire restera dans le puits) et tamponnant la plaque sur une serviette en papier propre. Laver les cellules en les remettant en suspension dans 200 ul de PBS suivis d'une centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C. Effectuer tous les lavages de cette façon, sauf indication contraire. Note: Ne pas utiliser PBS + 2% comme il va interférer avec le PI tache réparable. Eliminer le surnageant en feuilletant la plaque et ajouter 100 ml de colorant commerciale fraîchement préparé (par exemple, fixable Red Dead tache de cellule) à chaque puits. Faire la tache par dilution de la solution réactive 1:10 colorant dans du DMSO suivi par une dilution 1:10 dans PBS. Incuber la plaque à 4 ° C pendant 30 min à l'abri de la lumière. Centrifuger le pfin pendant 10 min à 300 g à 4 ° C. A ce point de l'avant, effectuer tous les travaux avec la plaque avec la culture de tissus hotte lumière éteinte. Eliminer le surnageant en feuilletant la plaque, puis ajoutez 100 ml de solution de bloc Fc. Préparer une solution de bloc Fc par dilution Fc bloc solution stock 1: 100 dans du PBS. Diluer anticorps à utiliser pour la coloration de la surface (par exemple, anti-CD4 ou anti-CD8) dans du PBS et ajouter 100 ml à chaque puits. Incuber la plaque à 96 puits pendant 30 min à 4 ° C à l'abri de la lumière. Remarque: les anticorps de taches de surface devraient être titrés pour des performances optimales. Typiquement utiliser une dilution de 1: 400, selon le protocole du fabricant: 200 ou 1. 3. intracellulaire coloration pour l'histone H3 Après incubation de la tache de surface, laver les cellules deux fois dans PBS. Après le dernier lavage, ajouter 100 pi de paraformaldehyde à 4% dans chaque puits. Incuber la plaque à 96 puits pendant 5 min à température ambiante. Assurez paraformaldéhyde 4% par dilutment 16% de paraformaldehyde dans du PBS. Faire de cette nouvelle. Laver les cellules deux fois dans PBS. Assurez solution Perm / Block (solution mère de Perm est PBS + 2% + 0,02% de Triton X-100, conserver à 4 ° C) en combinant 2 ml de sérum de lapin normal par 100 ml de solution de Perm. Faire assez pour 60 ml / échantillon. Ajouter 40 ml Perm / Bloquer pour chaque échantillon et bien mélanger par pipetage de haut en bas, en prenant soin de ne pas faire des bulles. Incuber la plaque à température ambiante pendant 45 min dans l'obscurité. Enregistrer restant Perm / Bloquer pour l'étape 3.6. Diluer anticorps conjugué fluorescence Histone H3K4me1 en solution Perm / bloc réservé à l'étape 3.5 et ajouter 10 ul de cette dilution dans chaque puits. Mélanger doucement par pipetage de haut en bas. Incuber la plaque à 96 puits dans l'obscurité pendant 1 h à 4 ° C. Remarque: Utilisez un anticorps H3K4me1 conjugué en utilisant le kit de conjugaison R-phycoérythrine en suivant les instructions du fabricant. Laver les cellules deux fois dans du PBS + 2%. Reprendre les cellules dans 200pi de PBS + 2% et de transférer les échantillons à tubes FACS pour cytométrie de flux. Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C dans l'obscurité. Pour des résultats optimaux analyser les échantillons un délai de deux jours. Singly échantillons colorés peuvent être utilisés comme la cytométrie de flux contrôles de compensation.