A citometria de fluxo para avaliar o estado de cromatina em células T

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo animal foi aprovada pelo (número Permit: A3242-01) Comitê Animal Care Institucional e Use Universidade Furman. Todos os materiais e equipamento utilizados no presente protocolo podem ser encontrados na Tabela de materiais e equipamentos, enquanto que os tampões usados ​​podem ser encontrados na Tabela de tampões e soluções. 1. suspensão única célula de linfócitos de rato baços Sacrifício camundongos através de asfixia com CO2. Confirme a eutanásia por deslocamento cervical. Nota: Use os baços de dois 6-8 semanas de idade camundongos isogênicos (por exemplo, C57B / 6) do mesmo sexo. Tipicamente, dois baços são processados. Pulverize os animais profusamente com uma solução de etanol a 70% e orientar de modo que a cabeça está virada para a esquerda. Usando fórceps, levantar a pele do animal para cima e para fora a partir de tele corpo. Com uma tesoura, um pequeno entalhe cortado através da pele perto do abdómen do animal. Utilizando os dedos, puxam-se os lados do entalhe para expor o peritoneu do pescoço para o início das patas traseiras. O baço deve ser visível diretamente abaixo do peritônio. Usando fórceps, levantar o peritoneu e fazer uma pequena incisão para expor o baço. Remover o baço com uma pinça e usar a tesoura para arreliar fora qualquer adiposo e tecido conjuntivo. Colocar o baço em um tubo de 50 ml contendo 10 ml de PBS suplementado com 2% de Soro Fetal Bovino (daqui em diante referida como PBS + 2%). Mantenha o tubo em gelo até estar pronto para iniciar a suspensão de células individuais. Nota: A recuperação típica é de entre 60-90 milhões de células por baço, e tipicamente, são necessários 2 milhões de células por amostra. Realiza todas as seguintes etapas em um capuz de cultura de tecidos. Decantar os baços em uma estéril 100 mm prato de cultura de tecidos. Obter duas lâminas de microscópio fosco e segure tele desliza de modo que as duas superfícies viradas para dentro fosco em bruto em direcção um ao outro. Molhar as lâminas na + 2% de solução PBS derramado na placa de Petri. Segurar o baço entre as superfícies foscas das lâminas, com as bordas ainda submersas, e moer suavemente o baço, movendo as lâminas e para trás de encontro uns aos outros (Figura 1A). As células vão cair na placa de Petri. Continue moagem até que todas as células foram liberados e os restos do baço aparecem em branco (Figura 1B). Desenha-se a suspensão de células em uma pipeta e filtrá-la lentamente através de um filtro de 70 um para um novo tubo de 50 ml estéril cónico. Note-se que pequenas pedaços de polpa vermelha estará presente no filtro (Figura 2A). Se o filtro sobe, levante suavemente-lo um pouco para permitir que o líquido escorrer através de e coloque o filtro de volta no tubo de 50 ml e continuar, repetindo este processo conforme necessário. Se o processamento de mais de 5 spleens, pode ser necessário dividir-se em dois lotes e utilizar um filtro para cada novo. Usando a parte de batente de uma seringa de 3 ml de pressionar suavemente a polpa vermelha contendo as restantes células através do filtro (Figura 2B). Certifique-se de pressionar a parte inferior do filtro ambos os lados e para assegurar que toda a polpa vermelha passou através do filtro (Figura 2C). Adicionar 10 mlof PBS + 2% para a cultura de tecidos prato e usar isso para lavar o slides, seringa rolha, e prato para recuperar as células restantes. Passe esta através do mesmo filtro de células 70 mm no tubo cônico de 50 mL. Repita este passo, conforme necessário. Centrifugar a suspensão de células filtrada a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Gentilmente decantar e desprezar o sobrenadante, cuidado para não perturbar o sedimento. Uma quantidade vestigial de PBS + 2% será deixado no tubo. Tapar o tubo e apertar o sedimento até o pelete é ressuspenso completamente. Lisar glóbulos vermelhos por anúncioDing 2 mL de ACK Tampão de Lise (0,15 M NH 4 Cl, 1 KHCO 3 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,2, armazenar a 4 ° C) por cada baço ao tubo cónico e rodar e inverter o tubo para assegurar que todas as células entrar em contacto com o tampão ACK. Agite suavemente o tubo durante 1 min a RT. Levar o volume da suspensão de células para 50 ml por adição de PBS + 2% do tubo para neutralizar o tampão ACK. Inverter o tubo 10 vezes e centrifugar durante 5 minutos a 300 xg, a 4 ° C. Após a centrifugação é completa, o sedimento deve ser branco (Figura 3). Gentilmente decantar e desprezar o sobrenadante, cuidado para não perturbar o sedimento. Deixar uma quantidade vestigial de PBS + 2% no tubo, a tampa do tubo, e agite o sedimento para ressuspender-lo. Adicionar 10 ml de meio de células T [10% FBS, HEPES 10 mM (pH 7,0), 2 mM de GlutaMax, piruvato 1 mM de sódio, aminoácidos não essenciais 1x, 1x penicilina / estreptomicina e 50 mM de β-mercaptoetanol], e mais ressuspender o sedimento por delicadamentepipetando para cima e para baixo. Depois filtra-se a suspensão através de um novo filtro de 70 um para um novo tubo de 50 ml. Use outros 5-10 ml de meio de células T para enxaguar o tubo original e esta passar através do filtro de 70 um para o tubo contendo o resto das células filtradas. Se o processamento de mais de dois baços, o volume de meio de células T pode ser aumentada para maximizar a recuperação. Manter as células em gelo até estar pronto para ser manchada. As células devem ser contados e viabilidade acessado. Para contar as células, combinar 3 ml de células com 24 ml de PBS + 2% e 3 ml de 0,4% de azul de tripano. Carga de 10 ml desta em cada câmara de um hemocitômetro Neubauer melhorada. A viabilidade, tal como avaliado por exclusão de azul de tripano, é tipicamente entre 85-95%. 2. Viabilidade e coloração da superfície Células de pellets por centrifugação durante 10 min a 300 xg, a 4 ° C. Ressuspender as células em meio de células T a uma concentração de 1 x 10 7 células / ml. Transfer de 2 milhões de células (100 ml) para um poço de uma placa de 96 poços de cultura de tecido de fundo em U. Centrifugar a placa de 96 poços durante 10 min a 300 xg, a 4 ° C. Remover o sobrenadante de cada cavidade por um movimento súbito líquido dentro da placa bem na pia (o sedimento de células permanecerá no poço) e secando a placa sobre uma toalha de papel limpa. Lavam-se as células por ressuspensão em 200 ul de PBS seguido de centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Executar todas as lavagens desta maneira salvo indicação em contrário. Nota: Não use PBS + 2%, uma vez que irá interferir com a mancha PI solucionáveis. Remover o sobrenadante por um movimento súbito da placa e adicionar 100 mL de mancha comercial recentemente preparada (por exemplo, células mortas mancha vermelha fixável) a cada poço. Adicione a mancha por diluição da solução stock de 01:10 corante reactivo em DMSO seguido por uma diluição de 1:10 em PBS. Incubar a placa a 4 ° C durante 30 minutos ao abrigo da luz. Centrifugar a pfinal durante 10 min a 300 xg, a 4 ° C. Neste ponto para a frente, executar todo o trabalho com a placa com a cultura de tecidos capô luz. Remover o sobrenadante por um movimento súbito da placa e, em seguida adicionar 100 ml de solução de bloqueio de Fc. Faça solução bloco Fc diluindo Fc solução estoque bloco 1: 100 em PBS. Anticorpos diluído para ser utilizado para a coloração de superfície (por exemplo, anti-CD4 ou anti-CD8) em PBS e adicionar 100 ml a cada poço. Incubar a placa de 96 poços durante 30 min a 4 ° C protegida da luz. Nota: anticorpos mancha de superfície devem ser tituladas para o desempenho ideal. Normalmente, utilizam uma diluição de 1: 400, por protocolo do fabricante: 200 ou 1. 3. A coloração intracelular para histona H3 Após a incubação, a mancha da superfície, lavar as células duas vezes em PBS. Após a última lavagem, adicionar 100 uL de paraformaldeído a 4% a cada poço. Incubar a placa de 96 poços durante 5 min à TA. Faça paraformaldeído a 4% por diluting 16% de paraformaldeído em PBS. Faça deste fresco. Lavar as células duas vezes em PBS. Adicione solução Perm / bloco (solução estoque é Perm PBS + 2% + 0,02% de Triton X-100, armazenar a 4 ° C) através da combinação de 2 ml de soro de coelho normal por 100 ml de solução de estoque de Perm. Faça o suficiente para 60 ml / amostra. Adicionar 40 ml Perm / Bloco a cada amostra bem e misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo, tomando cuidado para não fazer bolhas. Incubar a placa a temperatura ambiente durante 45 min no escuro. Salve restante Perm / Bloco para a etapa 3.6. Dilui-se conjugado anticorpo fluorescentemente Histona H3K4me1 em solução Perm / Bloco reservados na etapa 3,5 e adicionar 10 ul desta diluição para cada cavidade. Misture cuidado pipetando para cima e para baixo. Incubar a placa de 96 poços no escuro durante 1 hora a 4 ° C. Nota: Utilizar um anticorpo conjugado H3K4me1 utilizando o kit de conjugação com R-Ficoeritrina, seguindo as instruções do fabricante. Lavar as células duas vezes em PBS + 2%. Volte a suspender as células em 200ul de PBS + 2% e transferir as amostras para tubos FACS para análise de citometria de fluxo. As amostras podem ser armazenadas a 4 ° C no escuro. Para resultados óptimos analisar as amostras dentro de dois dias. Isoladamente amostras coradas pode ser utilizada citometria de fluxo como controles de compensação.